1、ICS 67120B 45中华 人民共和 国国家标准农业部1025号公告一122008鸡肉、猪肉中四环素类药物残留检测液相色谱一串联质谱法Determination of tetracyclines residues in mussle of chicken and swineby liquid chromatography-tandem mass spectrometry20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布目 次农业部1025号公告一122008前言- 1范围 2规范性引用文件3制样- 31样品的制备-32样品的保存 4测定方法 - 41方法提要或原理 一42试
2、剂和材料- 43仪器和设备44测定步骤- 45结果计算和表述5检测方法灵敏度、准确度、精密度 51灵敏度52准确度53精密度 附录A(资料性附录)四环素类药物总离子流(TIC)及特征离子质量色谱图I农业部1 025号公告一1 22008前 言本标准附录A是资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归LI。本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：王树槐、孙雷、汪霞、刘琪、刘艳华。本标准系首次发布的国家标准。农业部1025号公告一122008鸡肉、猪肉中四环素类药物残留检测液相色谱一串联质谱法1范围本标准规定了动物性食品中四环素、土霉素及金霉素单个或混合物残留检测的制样和高效液相
3、色谱一串联质谱的测定方法。本标准适用于猪肉、鸡肉组织中四环素、土霉素及金霉素单个或混合物残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和试验方法农牧发FZ0031号兽药残留试验技术规范(试行)3制样3 1样品的制备取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，绞碎并使均匀。32样品的保存-20以下冰箱中贮存备用。4测定方法41方法提要或原
4、理试料中残留的四环素、土霉素及金霉素经McIlvaineNazEDTA缓冲液提取，HLB柱净化。用高效液相色谱一串联质谱法测定，外标法定量。42试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GBT 6682规定的一级水。421盐酸四环素：含盐酸四环素(c2：H。C1N：Oe)不得少于97。4 2 2盐酸土霉素：含盐酸土霉素(C2zHzsClNzO。)不得少于96。423盐酸金霉素：含盐酸金霉素(c2zHztClzNzOs)不得少于83。4 2 4柠檬酸(c。Hs 07Hzo)：分析纯。425磷酸氢二钠(Na。HP0412H20)：分析纯。4 2 6乙二胺四乙酸二钠(c1。H1
5、4N2Na2082H20)：分析纯。427氢氧化钠：分析纯。4 2 8甲醇：色谱纯。4 2 9甲酸：分析纯。4 2 10乙腈：色谱纯。1农业部1025号公告一1220084 2 11氢氧化钠溶液(1molL)：取氢氧化钠4 g，加水溶解并稀释至100mL，即得。4212 Mcllvaine-NazEDTA缓冲液：分别取柠檬酸129 g，磷酸氢二钠109 g，乙二胺四乙酸二钠372 g，加水900mL溶解，用1molL氢氧化钠溶液调pH至4oo5，加水稀释至1 000mL，即得。4 2 13四环素、土霉素和金霉素标准储备液：分别取盐酸四环素、盐酸土霉素和盐酸金霉素对照品适量，精密称定。按四环素、
6、土霉素和金霉素计，用甲醇溶解并稀释成浓度均为1 mgmL的溶液，作为标准储备液。置-20冰箱中保存，有效期为1个月。4 2 14四环素、土霉素和金霉素工作液：精密量取标准储备液适量，用甲醇水(3+7，vv)溶液稀释成适宜浓度的四环素、土霉素和金霉素标准工作液。临用前配制。4 3仪器和设备4 3 1液相色谱串联质谱仪(配电喷雾、离子源)。4 3 2天平：感量oOl g。4 3 3分析天平：感量o000 01 g。4 3 4漩涡振荡器。4 3 5振荡器。43 6组织匀浆机。4 3 7离心机。438酸度计。4 3 9离心管：50 mL。4 3 10固相萃取柱：HLB柱(60 mg3mL)。4 3 1
7、1样品浓缩器。4 3 12微孔滤膜：o45m。44测定步骤4 4 1试料的制备试料的制备包括：取绞碎后的供试样品，作为供试试料；取绞碎后的空白样品，作为空白试料；取绞碎后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。4 4 2提取取lO 000 rmin匀浆1 min的试料(2：h005)g，置50 mL离心管中，加Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液8 mL，涡动充分混匀，8 000 rmin离心10 min(tN度低于15。C)，取上清液于另一离一fl,管内。重复提取一次，合并上清液，备用。443净化HLB固相萃取柱依次用甲醇5mL、水5mL预洗。取备用液8mL过柱，用水5m
8、L、5甲醇水溶液5 mI淋洗，减压抽干。用甲醇5 mL洗脱，氮气吹干洗脱液(温度低于40。C)。用甲醇一水(3+7)10 mlAg解残余物，过滤膜后作为试样溶液，供高效液相色谱串联质谱仪测定。4 4 4标准曲线的制备精密量取标准储备液适量，用甲醇一水(3+7)溶液稀释成含四环素、土霉素和金霉素分别为lO ngmL、20 ngmL、50 ngmL、100 ngmL、200 ngmL、400 ngmL的系列工作液，供高效液相色谱串联质谱仪测定。4 4 5测定4451液相色谱条件2农业部1025号公告一122008色谱柱：XBridge C18 150mmX21mm(id)，粒径5“m，或相当者；流
9、动相：A：03的甲酸乙腈溶液，B：03的甲酸水溶液；梯度洗脱：0min10min，10A线性变化至35A；10min15rain，35A线性变化至10A15 min25 min，10A；流速：02 mLrain；柱温：20；进样量：20“L。4 4 5 2质谱条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电离电压：25 kV；源温：80；雾化温度：200；锥孔气流速：50 Lh；雾化气流速：310 Lh；定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞能量见表1。表1 三种四环素类药物定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞能量药物 定性离子对，mz 定量离子对，m 锥孔电压，V 碰撞能量，e
10、V445410 18四环素 445410 264452428 12461426 20土霉素 461426 2546144314479444 23金霉素 479444 32479462 194 4 5 3测定法取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按外标法以峰面积计算，即得。对照溶液及试样溶液中四环素、土霉素和金霉素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。标准溶液和试样溶液的总离子流和特征离子质量色谱图分别见附录A中图A1、图A2。446空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。45结果计算和表述按式(1)计算试料中四环素、土霉素和金霉素的残留量：XAc,V1V3(1) A
11、ty 2m式中：X试料中四环素、土霉素和金霉素的残留量，单位为纳克每克(ngg)；A试样溶液中相应药物的峰面积；A，标准溶液中相应药物的峰面积；c。标准溶液中相应药物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；U提取试料后缓冲液的总体积，单位为毫升(mL)；U过固相萃取柱所用备用液体积，单位为毫升(mL)；砜溶解残余物的体积，单位为毫升(mL)；3农业部1025号公告一122008m供试试料的质量，单位为克(g)。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。5检测方法灵敏度、准确度、精密度51灵敏度四环素、土霉素和金霉素在猪肉、鸡肉组织中的检测限为5 ngg，定量
12、限为10 ngg。5 2准确度本方法在50 ngg200 ngg添加浓度的回收率为60120。5 3精密度本方法的批内变异系数20，批间变异系数20。4农业部1 025号公告一122008附录A(资料性附录)四环素类药物总离子流(TIC)及特征离子质量色谱图10 00 20 0007：罢。02 9_47 邶6曲anl盎巍，。j 9。471 砑酒誉I f_祟 1j5l 眦6曲anl毙100j 02 ”荡岩一。l，J?；，一夏一一，獬是一一二二黧1土霉素得到的特征离子质量色谱图(4610)426 o)52四环索得到的特征离子质量色谱图(445O410 o)；3u-金霉素得到的特征离子质量色谱图(4
13、790444 o)。图A 1 40gmL标液中三种药物11c和特征离子质量色谱图农业部1025号公告一1220086lOng spiked071127-030727-Nov-2007MRM of 6 Channels ES+5 00 In00 1500 2000112703o zt7 MRM of 6 Chartnel9 ES+99 9。6：。 ：恐42：一，i，!，一112703 。 MRM of 6 Char,1 ES99 10，8 44nel5s4m。10+菱罂一一通麟，一一二二=臻5 00 10 00 15 00 20001土霉索得到的特征离子质量色谱图(46104260)；2四环索得到的特征离子质量色谱图(4450410o)3金霉素得到的特征离子质量色谱图(479 0444o)。图A 2 10rigg空白猪肉添加试液中三种药物TIC和特征离子质量色谱图
