1、ICS 67040X 00中华人民 共禾口 国国家标准农业部1025号公告一182008动物源性食品中卢一受体激动剂残留检测液相色谱一串联质谱法Determination of卢一agonists residues in animal derived foodby liquid chromatography-tandem mass spectrometry20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布目 次前言1范围 2规范性引用文件3制样 31样品的制备 32样品的保存 4测定方法 一41方法提要或原理- 42试剂和材料-43仪器和设备44测定步骤 45结果计算和表述5检
2、测方法灵敏度、准确度和精密度51灵敏度 一52准确度 53精密度 附录A(资料性附录)口一受体激动剂特征离子质量色谱图农业部1 025号公告一1 82008农业部1025号公告一182008刖 吾本标准附录A是资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：王树槐、孙雷、朱永林、张骊、汪霞。农业部1 025号公告一1 82008动物源性食品中卢一受体激动剂残留检测液相色谱一串联质谱法1范围本标准规定了动物源性食品中特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗和喷布特罗残留检测的制样和液相色谱串联质谱测
3、定方法。本标准适用于猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋中特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗和喷布特罗单个或混合物残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。农业部农牧发200311号兽药残留试验技术规范(试行)3制样3 1样品的制备3 1 1猪肝和猪肉取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，绞碎并使均质。3 1 2牛奶取适量新鲜或
4、冷冻的空白或供试牛奶，混合均匀。3 1 3鸡蛋取适量新鲜或冷藏的空白或供试鸡蛋，去壳后混合均匀。3 2样品的保存上述制备的猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋样品-20以下贮存备用。4测定方法4 1方法提要或原理试料中的残留药物经酶解，用高氯酸调pH后高速离心沉淀蛋白，上清液调pH后分别用乙酸乙酯和叔丁基甲醚(TBME)提取，再用MCX固相萃取柱净化，液相色谱一串联质谱法测定。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GBT 6682规定的一级水。4 2 1特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗和喷布特罗对照品：纯度均大于98O。4 2
5、2乙酸铵缓冲液(o2 tooLL)：称取154 g乙酸铵，溶解于1 000 n1L水中，用适量乙酸调pH至52。4 2 3高氯酸：7072。4 2 4高氯酸溶液：01 moIL。4 2 5氢氧化钠溶液：10moLL。农业部1025号公告一侣20084 2 6乙酸乙酯。4 2 7叔丁基甲醚。428甲醇：色谱纯。4 2 9甲酸水溶液：2。4 2 10氨水甲醇溶液：3H。4 2 11 甲醇01甲酸溶液(10+90，VV)。4212 p一盐酸葡萄糖醛苷酶芳基硫酸酯酶(p Glucuronidasearyl sulfatase)。4 213标准储备液(100“gmL)：准确称取适量的特布他林、西马特罗、
6、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗和喷布特罗对照品，用甲醇分别配制成100tgmL的标准储备液，20冰箱中保存，有效期为6个月。4 2 14混合标准储备液(1xgmL)：分别准确吸取10 mI。的特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗和喷布特罗标准储备液至100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，-20冰箱中保存，有效期为6个月。4 3仪器和设备4 3 1液相色普串联质谱仪(配电喷雾离子源)。4 3 2涡旋振荡器。4 3 3高速离心机。4 34电热恒温振荡水槽。4 3 5 pH计。4 3 6固相萃取装置。43 7 MCX固相萃取柱
7、：60 rag3 mI。4 3 8氮吹仪。4 4测定步骤44 1试料的制备试料的制备包括：取均质的供试料品，作为供试试料。取均质的空白样品，作为空白试料。取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。442酶解准确称取2 g(精确到001 g)测试样品于50 mL离心管内，加人02 moLL乙酸铵溶液(pH一52)80mL，再加入口盐酸葡萄糖醛苷酶芳基硫酸酯酶40pL，涡旋混匀，于37。C下避光水浴振荡16 h。4 4 3提取酶解后放置至室温，涡旋混匀，10 000 rmin高速离心10min，倾出上清液于另一50mI。离心管内，加入01 moI。L高氯酸溶液5 mL，涡旋混匀
8、，用高氯酸调pH至10-02，10 000 rmin离心i0 min后，将上清液转移至另一50mL离心管内。用iomoLI。NaOH溶液调pH至95=02，加入乙酸乙酯15mL，涡旋混匀，并振荡10min，5 000 rmin离心5min，取出上层有机相至另一50mL离心管内。再在下层水相中加入叔丁基甲醚10mL，涡旋混匀，并振荡10min，5 000 rmin离心5min，合并有机相，50。C下氮气吹干，用2H甲酸溶液5 mL溶解，备用。4 4 4净化MCX固相萃取柱依次用甲醇、水、2甲酸溶液各3 mL活化，取备用液全部过柱，再依次用2甲酸溶液、甲醇各3 mL淋洗，抽干，用3氨水甲醇溶液25
9、 mL洗脱；洗脱液在50。C下用氮气吹干。2农业部1025号公告一182008残余物用甲醇01甲酸溶液(10+90，Vv)02mI。溶解，涡旋混匀，15 000 rmin高速离心10 min，取上清液适量，供液相色谱串联质谱仪测定。44，5空白添加标准曲线的制备分别精密量取9种口一受体激动剂混合标准工作液适量，添加到2 g空白试料中，制得浓度为025、05、1、2、5 t,gkg的各系列空白添加试料，按442444步骤操作，供液相色谱一串联质谱测定。4 4 6测定4 4 6 1液相色谱参考条件色谱柱：BEH C18(5021 mm，17”m)，或相当者；流动相：A相：01甲酸乙腈溶液；B相：0
10、1甲酸水溶液；梯度洗脱：0 min2 min，维持4A；2 min-、，12 min，4YoA线性变化至60A；12 mintl21 min，60A线性变化至4A；121 min16 min，维持4A；流速：03 mLmin；柱温：30；进样量：lo“L。4 4 6 2质谱参考条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电离电压：32 kV；源温：110；雾化温度：350；锥孔气流速：50 Lh；雾化气流速：650 Lh；药物保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量见表1。表1 9种口一受体激动剂保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量保留时间 定性离子对 定
11、量离子对 锥孔电压 碰撞能量药物(min) (mz) (mz) (V) (eV)22615124 67 22特布他林 1 94 226 1515174 852261515174 152201820195 lO西马特罗 1 98 22018201 96 20220 1812977 16240 1714770 18沙丁胺醇 208 240171147 70 222401722197 10304 1613461 18非诺特罗 3 83 304 1510659 363041511065930214 131153 75 18氯丙那林481 2141315375 25214 13195 97 123023
12、310677 28莱克多巴胺 d 96 302331163 87 25302331638715277 11202 78 15克仑特罗 538 2771l20278 262771125894 1022822153 90 15妥布特罗 5 39 228221153 90 252282217188 1229236123622 1 5喷布特罗 8 76 2923623622 30292362010020农业部1 025号公告一1 820084 4 6 3测定法取试料溶液和空白添加标准溶液，作单点或多点校准，外标法计算，即得。试料溶液及空白添加标准溶液中特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、
13、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗和喷布特罗的峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。试料溶液中的离子相对丰度与空白添加标准溶液中的离子相对丰度相比，符合表2的要求。对照溶液和空白添加标准溶液中各特征离子的质量色谱图分别见附录A中图A1图A5。表2试料溶液中离子相对丰度的允许偏差范围相对丰度() 允许偏差()50 土202050 土2510-20 土3010 504 4 7空白试验取空白试料，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。4 5结果计算和表述单点校准 X一弩熟 A m或空白添加标准曲线校准：由A，一nX，+b，求得n和b，则 x一型(2)“式中：x供试试料中口一受体激动剂残留量，,gkg；X。空
14、白添加试料中相应口受体激动剂浓度，,gkg；A供试试料溶液中相应口一受体激动剂峰面积；A空白添加试料溶液中相应口受体激动剂峰面积；Tit：空白添加试料质量，g；m供试试料质量，g。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。5检测方法灵敏度、准确度和精密度5 1灵敏度特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗和喷布特罗在猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋中的检测限为025 ngkg，定量限为05,gkg。5 2准确度本方法在05,g妇2 ogkg添加浓度范围内，用空白添加标准校正，其回收率范围为70120。53精密度本方法批内相对标
15、准偏差20，批问相对标准偏差20。附录A(资料性附录)口一受体激动剂特征离子质量色谱图农业部1025号公告一1820085“g，mL std08033136 9：MRM of 3 Ch蛐nels ES十， 876 292 36236 22誊 JI 5 28e402 00 4 00 600 8 00 10 00 12 00乱，一，k一，一，二15拟39， 538 277 11202 78*I z淼04 00 10 00 t916 302 33163 87司 l m二0+1_。广-”_-_17”T”1-Hr_1。厂TT”1。广T7_r”7P1-T”1Tr-几Time2 00 10 00 12 00
16、8 00 10 00Z 4()0 6 00 8_00 10 00 12 0008033l一361 98 2：MRM。f 2 Chmmels ES+ l 22018201 95小j 1 86“02 00 4 00 600 8 00 10 00 12 0008033136】94 1：MRM 0f 2 Chls ES十乱k，一一，一，一，一： 200 4 00 6 00 8 00 1000 12 0015l 741 46e4Time图A 1 5 rigniL混合标液中9种p一受体激动剂特征离子质量色谱图淼_令mL沮农业部1025号公告一1820080 5n以liver spiked080331370
17、80308039：MRM 0f 3 Channels ES+292 36236 22。j s。：6炒2 0T几_rT_几TT_Tr11_1_rr广TT_1_-1_广_Tr几Th4#呙千千_TTl_-_广Tm4 004 0010004 00_是一，且一，一，一，302 33l=163 8374，OO 5n以liver spiked080331-37 5：MRM of 2 Channels ES十乱，一玉一，一一一一=i153：7“5 2 00 12 004：MRM of 2 ChaIlnels ES+乱一，一，一，一，一三攀08033137 3：MRM of 3 Channels ES+205丸
18、L，一一，一，一二攀2 00 4 00 600 8 00 10 00 120008033137 2：MRM of 2 Ch8nneIs ES+1 98 I 22018201 95誉 fI 1 68“1200 4 00 6 00 800 10 00 12 00080331一”。93 1：MRM of 2 ChaIlnels ES+1 l 22615151 74_ 基 2 43 618e30 Time2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 1200图A 2 0 5gg空白猪肝添加试液中9种卢一受体激动剂特征离子质量色谱图n墨O0 5gg muscle spiked08033123农业部
19、1025号公告一1820089MRM of 3 Channels ES+292 36236 22司 102 00 400 6 00 8 00 10 00 12 0008033123 8：MRM of 2 Channels ES+540228 22153 9j j 2 86“鬟 40200 4 00 600 8 00 10 00 12 0008033123 7：MRM of 2 Channels ES+202 782 37e4z LM 4 uu 6删8【】【】 10【m 120008033123 6：MRM of 3 Channels ES+4 96 302 33163 87一ql 6 177e
20、40+_n_r_nTr_Tn_r1_n斗_卜几TT_TT几TrnTT_TTr_-_广TT_1_rr厂-rrT_广1 TimeO 5ngg muscle spiked08033123 5：MRM of 2 Ch1s ES十4 82 21413153 75美 0 王38“0200 4 00 6 00 8 00 1000 12 0008033123 4：MRM of 2 Chtmnels ES+400106 59207e47147 7742e32 00 400 6 00 8 00 10 00 12 0008033123 2：NRM of 2 Chls ES+1 98 22018201 95i n 2
21、 97e402 00 400 6 00 8 00 1000 12(El08033123 I：MRM。f 2 Channel8l ES+193 226 15151 74-女 0 979e30 L_+卜T几Tr。T_丁广TT几T1T-1_广T_rr叮T丌TTlTn_T_-_卜7rTT_Tlme2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 12 00图A 3 0 5gg空白猪肉添加试液中9种卢一受体激动剂特征离子质量色谱图墨O农业部1025号公告一182008丸，一一一，一l墨k77，一，2，9236215363e3228_000080409-080005 40 228 22153 9sj l
22、 。诋，00 00 2 50 5 00 7 50 10 00 12 5008040908 7：MRM of 2 Ch1s ES+一 5o 27711202 78sj 2 31e31O 00080409-087 50 10 001 4f6 302 3316387女 l 215e31 Time0 00 2 50O 5n以lrIllk spiked080409-085 004 p2 214 13153 75*j ，一，O 00080409-085 00106 592 35e3Uuu 2，U )uu bu IU ou 1z 3u08040908 3 MRM of 3 Channels ES+2p5 2
23、40 17147 7*j I ”m20 00 2 50 5 00 7 50 10 00 12 5008040908 2：MRM of 2 Channels ES+1 P5 22018201 95i Jl 5 05e310 00 2 50 5 00 7 50 10 00 12 50080409一嘴 1 MRM 0f 2 Channels ES+ 1f1 22615151 74i 4 2 02e31 Time5 00 10 00图A 4 0 5 nrdg空白牛奶添加试液中9种p一受体激动剂特征离子质量色谱图0 5n以egg spiked080409-13农业部1 025号公告一1 820089：M
24、RM of 3 ChaIlnels ES+292 36236 22乱2，一一，一，肚_一， 0 00 2 50 5 00 7 50 10 00 12 50080409138：MRM 0f 2 Channels ES+一 520 228 22153 9摹 JI 89120 00 2 50 5 00 7 50 10 00 12 50080409-13 7 MRM J，fh一。1。0 00080409一135 004 96202 783 88e36MRM of 3 Channels ES+302 33163 87乱，一，L，一一， 0 00 2 50 5 000 5,gg egg spiked080
25、40913lO 00，4 f2214 13153 751537j I 。0 00080409-135 00Lk，一，一，二10删6590 00 1000080409-13l 962：MRM 0f 2 chls Es十乱：犁扯一，一一，一三2019s5图A 5 0 5ngg空白鸡蛋添加试液中9种p一受体激动剂特征离子质量色谱图农业部1 1725号公告一1 8200810注：1特布他林特征离子质量色谱图(2261515174)；2西马特罗特征离子质量色谱图(2201820195)；3沙丁胺醇特征离子质量色谱阁(2401 714770)；4非诺特岁特征离子质量色谱图(3041510659)；5氯丙那林特征离子质量色谱幽(214 1315375)；6莱克多巴胺特征离子质量色谱网(3023316387)7克伦特罗特征离子质量色谱图(2771120278)；8妥布特罗特征离子质量色谱网(2282215390)；9喷布特岁特征离子质量色谱图(29236)-23622)。
