1、ICS 67040x 00中华人民共和国国家标准农业部1025号公告一22008动物性食品中甲硝唑、地美硝唑及其代谢物残留检测液相色谱一串联质谱法Determination of metrouidazole，dimetridazole and their metabolitesin animal derived food by liquid chromatograph-tandemmass spectrometry method20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布刖 菁农业部1 025号公告22008本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提H和归口
2、。本标准起草单位：中国农业大学。本标准主要起草人：沈建忠、丁双阳、江海洋、李晓薇、曹兴元、程林丽、吴聪明。本标准系首次发布的国家标准。农业部1025号公告22008动物性食品中甲硝唑、地美硝唑及其代谢物残留检测 液相色谱一串联质谱法1范围本标准规定了动物源食品中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量检测的制量和液相色谱一串联质谱方法。本标准适用于猪肌肉和猪肝脏组织中甲硝唑、二甲硝唑、甲硝唑的代谢产物羟基甲硝唑、二甲硝唑的代谢产物羟甲基甲硝唑残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注El期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本
3、标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GW T 6682分析实验室用水规则和试验方法3制样3 1样品的制备取新鲜或解冻的空白或供试组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。3 2样品的保存-20冰箱中贮存备用。4测定方法4 1方法原理或提要用乙酸乙酯提取试样中的硝基咪唑类药物及其代谢物，经01 toolL盐酸溶液一正己烷液液分配除脂，再经MCX固相萃取柱净化，液相色谱一串联质谱法检测，色谱保留时间和质谱碎片离子共同定性，外标法定量。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GBT 6682
4、规定的二级水。4 2 1 甲硝唑对照品(metronidazole，MNZ)纯度98。4 2 2二甲硝唑对照品(Dimetridazole，DMZ)纯度98。4 2 3羟基甲硝唑对照品(Metronidazole-OH，MNZOH)纯度94。4 2 4羟甲基甲硝咪唑对照品(2一Hydroxymethyllmethyl一5一nitro一1Himidazole，HMMNI) 纯度94。4 2 5乙酸乙酯4 2 6乙腈42 7甲醇428盐酸4 29正己烷农业部1 025号公告220084 2 10氨水42”无水乙酸钠42 12冰醋酸42 13 MCX固相萃取柱60mg3cc4 2 14盐酸(0 1
5、tooLL)取9 mL浓盐酸，加水稀释至100 mL。4 2 15乙酸钠缓冲液(0 1 moLL)称取082 g无水乙酸钠溶解于800mL水中，用冰醋酸调节pH至43，加水稀释至1 000mL。42 1G硝基咪唑类药物及其代谢物标准储备液(100gmL)分别称取甲硝唑、二甲硝唑、羟基甲硝唑、羟甲基甲硝咪唑各001 g，用甲醇溶解定容至100 mL，-20下保存，有效期6个月。4 2 17硝基咪唑类药物及其代谢物标准储备液(10 pgmL)取100 MgmL硝基咪唑类药物标准储备液5mL于50mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，-20下保存，有效期6个月。4218硝基咪唑类药物及其代谢物标准工作
6、液取适量的10“gmL硝基咪唑类药物标准储备液，用流动相稀释定容，依次制成浓度为1、2、5、10、50、100、500“gL的标准工作液。4。C冰箱中保存，有效期1个月。4 3仪器和设备4 3 1液相色谱一串联质谱仪432组织匀浆机4 3 3天平感量001 g4 3 4分析天平感量0 000 01 g435涡旋振荡混合器436固相萃取装置4 3 7离心机4 3 8氮气吹干装置43 9旋转蒸发仪44试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料。取制备后的空白样品，作为空白试料。取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4 5测定步骤451提取称取(2o02)g试样
7、于50mL离心管中，加15mL乙酸乙酯，涡动2min，4 000 rrain离心5min。上清液转移至100 mL鸡心瓶中，残渣用15 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并两次提取液，40。C水浴下旋蒸浓缩至干。452净化加01molL盐酸3mL，涡动1min充分溶解残渣，转移至15mL离心管中，向鸡心瓶中加3mL正己烷摇1 rain，转移至同一离心管中，手摇20次，4 000 rrain离心5 min，弃正己烷层，再加01 molL盐酸3mL于鸡心瓶中，涡动1min，合并两次盐酸溶解液，加3mL正己烷重复去脂一次，除尽正己烷2农业部1025号公告22008层，备用。取MCX固相萃取柱于固相萃取装置
8、上，依次用2 mL甲醇和01 molL盐酸2 mL平衡，备用液在重力作用下自然流过小柱，依次用01 molL盐酸溶液1 mL、甲醇1 mL、甲醇2氨水(10十90，vv)1 mL淋洗，在重力作用下流干，甲醇一5氨水(60+40，vv)3 mL洗脱，收集洗脱液。40C水浴下氮气吹干，加流动相1 mL溶解，过02“m有机滤膜，供液相色谱一串联质谱仪测定。4 5 3测定4 5 3 1色谱条件色谱柱：C8柱，150 mmX 21 ram(内径)，粒径5“m，或相当者；柱温：室温；进样量：10“L；流速；02 122Irain；流动相及梯度洗脱条件见表1。表1液相色谱梯度洗脱条件时间(min) 水()
9、乙腈()0o 100 o6o 0 10010o o 】oo20o 100 o4 5 32质谱条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；离子源温度：80；脱溶剂温度：300；毛细管电压：3 kV；脱溶剂气流速：445 Lh；锥孔反吹气流速：8 Lh；定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量，见表2。表2硝基咪唑类药物及代谢物的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量名称 定性离子对(mZ) 定量离子对(mz) 锥子L电压(V) 碰撞能量(ev)188144 16羟基甲硝唑 188125388188125320172128 16甲硝唑 172128221728225
10、158140 12羟甲基甲硝咪唑 158140 2415896 1514296 14二甲硝唑 14296 221428123454测定法4 5 41定性测定根据试样溶液中药物的含量，选择峰面积相近的标准工作液和样品溶液等体积参插进样。通过液3农业部1 025号公告一22008相色谱保留时间与质谱选择离子共同定性。样品中待测药物与标准物质的保留时间相对偏差不大于25，而且其选择离子的相对丰度的差异不大于20。4种药物标准溶品和试样溶液的选择离子色谱图见图A1A3。4 5 4 2定量测定分别取适量试样溶液和相应浓度的标准工作液，作单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中药物
11、的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。4 6结果计算和表述动物组织中硝基咪唑类药物及其代谢物的含量x，以质量分数微克每千克(tugkg)表示，按式(1)计算：X：CV(1)ITt式中：c试样液中对应的硝基咪唑类药物及其代谢物的浓度，单位为微克每毫升(tLgmL)；v溶解残留物所用流动相的体积，单位为毫升(mL)；m试样质量，单位为克(g)。测定结果用平行测定后的算术平均值表示，保留三位有效数字。5检测方法灵敏度、准确度、精密度51灵敏度本方法在猪肌肉、猪肝脏中的检测限均为02”gkg，定量限均为1“gkg。52准确度本方法在05 pgkg10 pg
12、kg添加浓度水平上的回收率为60120。53精密度本方法的批内变异系数15，批间变异系数20。附录A(资料性附录)选择离子色谱图农业部1025号公告22008819(VlNZOIt：羟基甲硝唑；HMMNI，羟甲基甲硝眯唑；MNZ：甲硝唑；DMZ：二甲硝唑)图A1猪肝中硝基咪唑类药物基质标准溶液选择离子色谱图ooo农业部1025号公告一220086斗一一一一二磁拦一一600 6 50 7 00 7 50时间900 9 50 10 00(MNZOH：羟基甲硝唑HMMNI：羟甲基二甲硝眯唑MNZ：甲硝唑；DMZ：二甲硝唑)图A2空白猪肝样品选择离子色谱图农业部1025号公告2200800j m屹丙j j 。o罩阡竹_rTr丌Trr；0二#拿=#；与叶下一800(MNZOH：羟基甲硝唑；HMMNI：羟甲基二甲硝眯唑MNz：甲硝唑iDMZ：二甲硝唑)图A3猪肝中10gg硝基咪唑类药物及其代谢物的选择离子色谱图7OO
