1、ICS 67120B 45中华人民 共禾口 国国家标准农业部1031号公告一32008猪肝和猪尿中B一受体激动剂残留检测气相色谱一质谱法Determination of Bagonist residues in swine liver and urineGas chromatographymass spectrometry method20080509发布 20080509实施中华人民共和国农业部发布刖 舌农业部1031号公告一32008本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：农业部畜禽产品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：吴银良、姜艳彬、刘兴
2、国、单吉浩、刘勇军、蔡英华、李艳华。农业部1031号公告一32008猪肝和猪尿中p一受体激动剂残留检测气相色谱一质谱法1范围本标准规定了猪肝和猪尿中8受体激动剂类药物(马布特罗、盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、班布特罗和莱克多巴胺)含量检测的制样和气相色谱质谱法的测定方法。本标准适用于猪肝和猪尿中8一受体激动剂类药物(马布特罗、盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、班布特罗和莱克多巴胺)含量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本
3、。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和试验方法3制样31样品的制备取适量猪尿3 000 rmin离心5 rain新鲜或冷冻的猪肝，绞碎并使均匀。3 2样品的保存一20冰箱中储存备用。4测定方法41方法提要或原理样品中呈结合态的B一受体激动剂类药物在乙酸铵缓冲溶液中经酶解后成游离状态，调节提取液pH，然后用乙酸乙酯和异丙醇混合溶剂萃取，萃取液旋转蒸干后用乙酸铵缓冲溶液溶解，过阳离子交换柱。净化后的样品氮气吹干后用双三甲基硅基三氟乙酰氨(BSTFA)衍生，然后采用选择离子模式进行气相色谱质谱分析。内标法定量。42试剂和材料除非另有说明，在分析中使用确
4、认的分析纯试剂，水为符合GBT 6682规定的一级水。4 2 1马布特罗：含马布特罗不得少于98o。4 2 2盐酸克伦特罗：含盐酸克伦特罗不得少于98o。4 23沙丁胺醇：含沙丁胺醇不得少于980。4 2 4班布特罗：含班布特罗不得少于98o。4 2 5莱克多巴胺：含莱克多巴胺不得少于98o。4 2 6美托洛尔：纯度不得少于980H。4 2 7乙酸铵。42 8乙酸乙酯。4 2 9异丙醇。1农业部1031号公告一320084 210氯化钠。4 2 11氢氧化钠。4 2 12乙酸。4 2 13甲醇：色谱纯。4 2 14氨化甲醇溶液4：用甲醇稀释4mL氨水至100ml。4 2 15乙酸乙酯与异丙醇混
5、合溶剂：体积比为6；4。4 2 16乙酸铵溶液002 molL：称取154 g乙酸铵，加水溶解并稀释至800 mL左右，调节pH至52，定容至1 000mL。4 2 17氢氧化钠溶液20 molL：取氢氧化钠40 g，加水稀释到500 mL。4 218 SCX小柱：supelclean，LCSCX Sep Pak小柱500mg，3mL，或相当者。4 2 19双三甲基硅基三氟乙酰氨(BSTFA)。4 2 20 8一葡萄糖醛酸苷酶(p glucuronidase)3 000 UmL，或相当者。4 2 21标准溶液的配制：4221 1储备液：分别精确称取10mg五种0一受体激动剂类药物于100mL容
6、量瓶中，均用甲醇配成浓度为i00 mgL的标准储备液，放在4冰箱中冷藏保存；有效期6个月。4 2 21 2工作液：分别吸取马布特罗、盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、班布特罗和莱克多巴胺标准储备液2mL、1mL、1mL、1mL和2mL于i00mL容量瓶中，有甲醇稀释至刻度，即成含马布特罗和莱克多巴胺2 mgL、其余三种口受体激动剂类药物1 mgL的标准工作液，存放在4冰箱中备用。4 222内标溶液的配制：精确称取10mg美托洛尔标准品于i00mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即成100 mgL的标准储备液，放在4冰箱中冷藏保存；有效期6个月。工作液：将储备液用甲醇稀释为500 ngmL，存放在4C冰箱中备
7、用。4 3仪器和设备4 3 1气相色谱一质谱联用仪(配自动进样器和EI源)。4 3 2分析天平：感量00001 g。433天平：感量0Ol g。4 3 4氮吹仪。4 3 5固相萃取装置。4 3 6取液器(量程200L1 000ffL)。437取液器(量程20 ffL100 ffL)。4 3 8匀质器。4 39旋涡混合器。4 3 10离心机。4 3 11烘箱：精度为3。4 3 12 pH计。4 313旋转浓缩仪。4 3 14色谱柱：HP一5 MS石英毛细管色谱柱，30mX025mm，膜厚025 p“，或相当者。44测定步骤4 4 1试料的制备试料的制备包括：取绞碎并均匀后的供试样品，作为供试试料
8、；农业部1031号公告一32008取绞碎并均匀后的空白样品，作为空白试料；取绞碎并均匀后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。442提取4421猪肝样品：称取(5o05)g试料于50mL离心管中，加入10mI。乙酸铵溶液，匀质1rain，加入50 pL 3 000 UmL的口一葡萄糖醛酸苷酶溶液和100 pL内标工作液，盖上盖子在60。C烘箱中酶解2 h。酶解后，以5 000 rrain离心10 min，收集提取液于另一50 mL离心管中，然后在残渣中再加入10mL乙酸铵溶液，匀质30 s，以5 000 rrain离心5min，合并提取液，用氢氧化钠溶液调节pH至95土02，再以
9、5 000 rrain离心5rain，吸取上清液，加人8 g氯化钠，振荡使溶解后待净化处理。4422猪尿样品：吸取50mL样品于50mL离心管中，用乙酸调节pH至52后加入1mL乙酸铵溶液和50 pL 3 000 UmL的p葡萄糖醛酸苷酶溶液和100 pL内标工作液，盖上盖子在60。C烘箱中酶解2 h。酶解后，用氢氧化钠溶液调节pH至9502后加入2 g氯化钠，振荡使溶解后待净化处理。4 43净化在样品提取液中加入乙酸乙酯与异丙醇混合溶剂萃取水相中的p受体激动剂类药物。其中，猪肝样品为20 mL，猪尿样品为10 mL，离心后吸取上清液，并以同样体积的混合溶剂萃取一次，合并萃取液在60。C水浴中
10、旋转浓缩至干，加入3 mL乙酸铵溶液待固相萃取净化。将上述溶液转移到已依次用5 mL甲醇、5 mL水和5 mL 30 mmolL的盐酸活化的阳离子交换柱上，然后用5mL水和5mL甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干SCX小柱，再用6mL 4氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，在50水浴中用氮气吹干。44 4衍生化在443吹干后的样品中加入甲苯和BSTFA各100“L，振荡混合后，封口，在80。C烘箱中衍生60 min，冷却后进行气质分析。4 4 5标准工作曲线制备采用空白样品中添加标准工作液的方法制备标准工作曲线，盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和班布特罗添加浓度分别为0 btgkg、10 Mgkg、20 pgkg、50x
11、gkg、100xgkg，马布特罗和莱克多巴胺的添加浓度为0xgkg、20 btgkg、40 tigkg、10O ogkg、200 pgkg，每个浓度点3个平行样，用平均值绘制标准曲线。4 46 GC-MS分析测定载气为高纯He，恒流09 mLmin；进样口温度：220；不分流进样；进样体积：1“L；色谱柱起始温度70。C(保持06 min)，以25。Crain的升温速率升至200。C(fit持4 min)，再以15rain的升温速率升至280。C(fit持5 rain)；GCMs传输线温度：280；溶剂延迟：7 min；EM电压：高于调谐电压200 V；离子源(EI)温度：200；四极杆温度：
12、160；选择离子监测：(mz)86，277，296，311(马布特罗)；86，212，262，277(盐酸克伦特罗)；86，350，369，440(沙丁胺醇)；72，223(美托洛尔)；86，277，333，352(班布特罗)；163，234，250，502(莱克多巴胺)。4 4 7定性定量方法4471定性：样品峰与标样的保留时间之差不多于2 s，并人工比较选择离子的丰度。其中，试样峰3农业部1031号公告一32008的选择离子相对强度(与基峰的比例)不超过标准相应选择离子相对强度平均值的20(标样中选择离子峰与基峰的强度比大于10H)或50(标样中选择离子峰与基峰的强度比小于10)。447
13、2定量方法：选择定量离子马布特罗(mz 86)、盐酸克伦特罗(mz 86)、沙丁胺醇(mz 369)、班布特罗(m屈86)和莱克多巴胺(mz 250)与内标离子(mz 72)的峰面积比进行单点或多点校准定量。44 8空白试验除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。4 5结果计算和表述试样中8一受体激动剂类药物的残留量(pgkg或pgL)按式(1)计算。x一丛型(1) m式中：x试样中8受体激动剂类药物残留含量，单位为微克每千克或微克每升(xgkg或ggL)；A试样色谱峰与内标色谱峰的峰面积比值对应的p受体激动剂类药物质量，单位为纳克(ng)；r试样稀释倍数；m试样的取样量，单位为克或
14、毫升(g或mL)。计算结果扣除空白值，保留到小数点后两位。5检测方法灵敏度、准确度和精密度51灵敏度本方法检测限：盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和班布特罗为10t*gkg(或,ugL)，马布特罗和莱克多巴胺为2O,gkg(或,ttgL)。52准确度本方法的回收率在60120范围内。5 3精密度本方法的批内变异系数cv、15，批间变异系数CV20。4附录A(资料性附录)p一受体激动剂质谱图和色谱图农业部1031号公告一32008鼍涨需J 86l Ab 867J)undlmee86900 000jA 260 000 d B800 0001 240 000700 000 j 220 000300 000I
15、108000 00000j篙删蝉醯：亚垃螋塑。璃业业矗鱼缝芷弩-”哪虬，鲫啦避：j卫粒丛始题s；嶙驯b2 1函竺叠缢弩IIl，2+200 400 ”“38 370Abundanee450 000400 000350 000300 000250 000200 000150 000100 00050 0000Abundanee900 000800 000700 000600 000500 000400 000300 000200 000100 0000mz峰100 200 300 400 500A马布特罗；B_盐酸克伦特罗；C一一沙丁胺醇；图A1F刊 1】14j812239 7320352 1 4
16、23 479513口美托洛尔E莱克多巴胺F班布特罗。p一受体激动剂类药物和内标物甲基硅烷化衍生物质色谱图农业部1031号公告一32008r马布特罗衍生物b 盐酸克伦特罗衍生物；c一一沙丁胺醇衍生物；d班布特罗衍生物；e莱克多巴胺衍生物。图A 2口一受体激动剂类药物标准溶液色谱图(盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和班布特罗浓度为100 pL，马布特罗和莱克多巴胺浓度为200阻gL)-绂， 【J 扎 b 止 址沁 0图A 3猪肝空白样品色谱图图A 4猪肝添加样品色谱图(盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和班布特罗添加浓度为1 Itgkg马布特罗和莱克多巴胺添加浓度为2tgkg)农业部1031号公告一320081000 1200 1400 11图A 5猪尿空白样品色谱图图A 6猪尿添加样品色谱图(盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和班布特罗添加浓度为1 IlgL马布特罗和莱克多巴胺添加浓度为2|嚷L)I川川川矿U矿 Iij胤一；础姗 110肌一m一衄蝴
