1、ICS 67120B 45中华人民共和国国家标准农业部1031号公告一12008动物源性食品中1 1种激素残留检测液相色谱一串联质谱法Determination of sex hormones in animal productsLCMS，MS method20080509发布 2008-0509实施中华人民共和国农业部发布勇。刖 昌农业部1031号公告一12008本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：华南农业大学、上海市兽药饲料检测所、北京市食品安全监控中心。本标准主要起草人：陈杖榴、贺利民、黄显会、陈建新、曾振灵、黄士新、曹莹、彭莉、官艳丽、黄华
2、、路本标准系首次发布的国家标准。农业部1031号公告一12008动物源性食品中1 1种激素残留检测液相色谱一串联质谱法1范围本标准规定了猪、牛、羊、鸡肌肉和肝脏、牛奶和鲜蛋等动物源食品中睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、N蛔-NN、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙等11种性激素的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于猪、牛、羊、鸡肌肉和肝脏、牛奶和鲜蛋等动物源食品中睾酮等11种性激素多残留的确证和定量测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本
3、标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法3原理动物肌肉、肝脏和鲜蛋匀浆样品及牛奶在碱性条件下，与叔丁基甲醚均质、震荡提取，提取液浓缩蒸干后用50乙腈水溶液溶解残渣，冷冻离心脱脂净化。液相色谱一串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料除方法另有规定外，试剂均为分析纯。实验室用水应符合GBT 6682中二级水的规定。41叔丁基甲醚：色谱纯。42乙腈：色谱纯。4 3甲醇：色谱纯。44甲酸。45 50乙腈水溶液：500份乙腈与500份超纯水混合，加1份甲酸，混匀。4 6 10碳酸钠溶液：称取100
4、g碳酸钠溶于100mL水中。4 7 01甲酸溶液：取1 mL甲酸用水稀释至1 000 mL，混匀。48睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙对照品：纯度98。4 9内标贮备溶液：100“gmL氘代睾酮标准溶液(一20保存，有效期6个月)。410 11种激素药物标准贮备溶液：01 mgmL。分别精密称适量的每种激素药物对照品至棕色容量瓶中，用甲醇配制成01 mgmL的标准贮备溶液(一20保存，有效期6个月)。4 1 1 11种激素药物混合标准中间溶液及内标中间溶液：10 kcgmL。分别准确量取适量的每种激素药物标准贮备溶液(410)和内标
5、贮备溶液(49)，用甲醇稀释成10 ugmL的11种药物混合标准中间溶液和内标中间溶液(4保存，有效期1个月)。412 11种激素药物混合标准工作溶液及内标工作溶液：准确量取适量的激素类药物及内标中间溶液农业部1031号公告一12008(411)，用乙腈水溶液(45)配制成浓度系列为100 ngmL、200 ngmL、500 ngmL、100 ngmL、200 ngmL、100 ngmL的激素药物混合标准工作溶液及内标工作溶液(4保存，有效期1周)。5仪器和设备51液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源。5 2分析天平：感量001mg和001 g各一台。5 3高速组织均质机。5 4高速冷冻离心
6、机。55旋涡振荡器。5 6旋转蒸发仪。5 7移液器：200 pL，1mL。5 8一次性注射式滤器：配有022肛m微孔滤膜。6试样制备与保存61试样的制备称取约100 g动物肌肉、肝脏，完全切碎后备用；取10枚鲜蛋，去壳备用；取鲜牛奶100mL，混匀备用。上述样品经高速组织均质机捣碎，用四分法缩分出适量试样，均分成两份(鲜牛奶混匀直接分为2份)，装入清洁容器内，加封后做出标记。一份作为试样，一份为留样。6 2试样保存试样应在一20条件下保存。7测定步骤71标准曲线制备制备标准混合工作液(412)，按74规定测定并制备标准曲线。72提取称取5 g(o05 g)试样，置于50 mL聚丙烯离心管中，加
7、氘代睾酮内标溶液适量，加人碳酸钠溶液(46)3 mL和25 mL叔丁基甲醚，均质30 s，振荡10 rain，4，6 000 rmin离心10 min，将上清液转移至梨形瓶中。将离心残渣用25 mL叔丁基甲醚重复再提取一次，合并上清液。73净化将上清液转移至50 mL梨形瓶，于40水浴中旋转蒸发至干。用乙腈水溶液(45)20 mL溶解残余物，漩涡混匀后，溶液冷冻30min，16 000 rmin离心5rain，取适量溶液经022 p“滤膜过滤至样品瓶中，供液相色谱一串联质谱仪测定。按72和73操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的样品空白提取液。74测定7 41液相色谱条件a)色谱柱：C
8、18(150 minX21 mm，粒径17肛m)。或其他效果等同的c18柱。b)流动相：乙腈+o1甲酸溶液(梯度洗脱见表1)。表1流动相梯度洗脱条件时间，min 01甲酸溶液， 乙腈，00 50 5050 10 90表1(续)农业部1031号公告一12008时间，mlu 01甲酸溶液， 乙腈，70 10 9075 50 50100 50 50c)柱温：30。d)流速：03 mLmin。e)进样量：10L。7 4，2质谱条件a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子模式；c)检测方式：多反应监测；d)脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到
9、检测要求ie)毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最佳灵敏度；f)定性离子对、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表2。表2 1 1种激素类药物的质谱参数(母离子均为M+H+)定性离子对 定量离子对 锥孔电压 碰撞能量被测药物名称V eV群勃龙 27151994 202715199445(trenbolone) 27142535 20勃地龙 28761354 1528761213 25(boldenone)287S1213 25诺龙 2752109，1 Z52753109I 35(nandrolone)27522573 15睾酮 2895973 25289，597335(testo
10、saterone) 28951091 30美雄酮(大力补) 30171214 2530171214 25(methandienone) 3017283610甲基睾酮 3035973 2530351094 30(rnethyltestosterone) 30351094 25司坦唑醇(康力龙) 3298814 453298814 45(stanozol01) 32981214 35氘代睾酮(内标) 2926973 2029261093 25(ntestosterone)29261093 20黄体酮(孕酮) 3155975 203155975 37(progesterone) 31551093 2
11、3丙酸诺龙 33161093 2033161093 25(rmndrolonepropionate) 33161454 20丙酸睾酮 3457973 2034571093 30(testosteroneproplonate) 34571093 22苯丙酸诺龙 40781054 2840781054 30(nandrolonephenylpropionate) 40782576 15农业部1031号公告一12008743液相色谱串联质谱测定7431定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合对照品基质标准溶液中对应的保留时间偏差在25之内，
12、且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的对照品基质标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较。若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差I)相对离子丰度 50 2050 lO20 10允许的最大偏差 20 士25 土30 士507432定量测定在仪器最佳工作条件下，混合对照品基质匹配标准工作液与试样交替进样，采用与测试样品浓度接近的单点基质匹配标准溶液外标法定量。或以氘代睾酮为内标，标准溶液中被测组分峰面积与氘代睾酮内标峰面积的比值为纵坐标，相应被测组分浓度为横坐标绘制工作曲线，用工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应
13、值均应在仪器测定的线性范围内。75平行试验按上述步骤，对同一样品进行平行试验测定。8结果计算结果按式(1)计算：X：一G全筹揣(1)式中：x：样品中被测激素药物的残留量，单位为微克每千克(pgkg)；e基质匹配标准溶液中对应激素药物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A试样溶液中被测激素类药物的色谱峰面积；A；基质标准溶液中对应激素药物的峰面积；m试样溶液所代表样品的质量，单位为克(g)；卜样品终定容的体积，单位为毫升(mL)。9检测方法灵敏度、准确度与精密度91灵敏度本方法在猪、牛、羊、鸡肌肉组织和鲜蛋中睾酮、甲基睾酮、勃地龙、美雄酮及司坦唑醇的检测限为03 pgkg，群勃龙、诺龙、丙酸诺
14、龙、黄体酮、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙为o4“gkg；在猪、牛、羊、鸡肝脏组织和牛奶中睾酮、甲基睾酮、勃地龙、美雄酮及司坦唑醇的检测限为o4“gkg，群勃龙、诺龙、丙酸诺龙、黄体酮、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙为o5“gkg。本方法在猪、牛、羊、鸡肌肉、肝脏组织和牛奶、鲜蛋中睾酮、甲基睾酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、黄体酮、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙的定量限为10“gkg。9 2准确度本方法在猪、牛、羊、鸡肌肉、肝脏组织、牛奶和鲜蛋中，11种激素药物在1o pgkg、2o pgkg、lo4农业部1031号公告12008pgkg三个添加水平上的回收率在50120。93精密度本方法在猪、牛、羊
15、、鸡肌肉、肝脏组织、牛奶和鲜蛋中，11种激素药物在10,gkg、20t,gkg、lOpgkg三个添加水平上回收率的变异系数40。农业部1031号公告一12008附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM】色谱图(浓度均为5 p舀L)080423-MIX 5PPB_2lJ=，一一，一 _11C1 40e41 00 2 00 3 00 400 5 00 6 00080423_MIX 5PPB_2 6：MRM of 1 Channel ES+1001 16l3 TIC摹 6美雄酮 3。删。j，+L，+，一1 00 2 00 300 400 5 00 60008042-MIX 5PPB-2 5：M
16、RM of 1 Channel ES+1001 19-5 TIC摹I 6 甲基睾酮一 188“oin，hThr毕毛单叮竹广T1叮_11_叮T1广r叮1111 00 200 300 400 500 600080423_MIX 5PPB_2 3：MRM of l Channel ES+100 1f1 TIC誉l 4 司坦唑醇 8名9“j 0jTnlT几1rnl，”￥HT7n7T11，1T几1T几T7rlnl，几Trnl”_100 200 300 400 500 600080423 MIX 5PPB_2 2：MRM of I Channel ES+100 lf7 TIC摹 l勃地龙 4脚。L。毒剐L
17、，一、100 200 3 00 400 500 600080423_MIX 5PPB_2 1MRM 0f 1 Channel ES+100 1f2 TIC摹 6群勃龙一 4。6o地酶紫竹*鼻掣一一。080423_MIX 5PPB_2农业部1031号公告一1200814：MRM of l Charmd ZS+l，一，。二二：搿，。l乱，一，。二：二磊且，。l 100080423缸X 5PPB_2_11C812e4400 5 00 60013：MRM 0f 1 Charmd ES+1一，二：二置一 100 200080423lJIX 5PPB 211C2lle44 00 12蠢R舯M0f 1 Cha6nn驾e ES+M 0f l404l_00 200 300080423_MIX 5PPB_2耵C5i7e3400 5 00 0011：MRM 0f1 Channel ES+乱，一：二曼鬻一，一， 1_00080423MI)(5PPB-2100掌O11C163e4400 5 00 6 0010：MRM of 1 Channel ES+100nC3 30e44舢 5 00 6001 00 400 5肿 6007
