1、ICS 65120B 46中华人民共和国国家标准农业部1063号公告一22008动物尿液中1 O种同化激素的检测液相色谱一串联质谱法Determination of anabolic androgenic steroids in animal urineLiquid chromatography-tandem mass spectrometry20080715发布 2008-0715实施中华人民共和国农业部发布刖 舌农业部1063号公告一22008本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江省饲料监
2、察所、上海市兽药饲料检测所、国家饲料质量监督检验中心(北京)、北京市饲料监察所。本标准主要起草人：朱聪英、黄士新、苏晓鸥、陈慧华、应永飞、赵根龙、韦敏珏、曹莹、郑君杰、孙志文、周文海、屈健、陆春波。农业部1 063号公告一22008动物尿液中10种同化激素的检测液相色谱一串联质谱法1范围本标准规定了动物尿液中甲基睾酮、大力补、睾酮、丙酸睾酮、去氢睾酮、诺龙、丙酸诺龙、群勃龙、康力龙、孕酮等10种同化激素的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于动物尿液中10种同化激素的测定，检测限为05ugL，定量限为10ugL。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的
3、引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样在pH7001条件下，37。C酶解，离心，上清液经C。s固相萃取柱净化后，氮气吹干，用乙腈水溶液溶解，进行液相色谱一串联质谱法测定，采用保留时间和离子丰度比定性，外标法定量。4试剂和材料除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯，水符合GBT 6682中一级水的规定。4 1乙腈：色谱纯。4 2甲醇：色谱纯。4 3 20molL盐酸溶液：取盐酸18mL，加水至1
4、00mL，即得。4 4 20molL氢氧化钠溶液：取氢氧化钠80 g，用水溶解后，定容至1 000mL，即得。4 5淋洗液：取甲醇(42)40 mI，加水定容至100 mI，摇匀，即得。4G乙腈水溶液：取50 mL水和50 mL乙腈混合，摇匀，即得。4 7甲基睾酮、大力补、睾酮、丙酸睾酮、去氢睾酮、诺龙、丙酸诺龙、群勃龙、康力龙、孕酮标准品：纯度950H。4 8标准贮备液配制：分别精密称取10种激素类药物标准品(47)至棕色容量瓶中，用甲醇配成浓度各为100 ugmL的激素类药物标准贮备液，置一20保存，有效期6个月。4 9混合标准丁作液：分别吸取一定量的10种激素类药物的贮备液(48)，置于
5、棕色容量瓶中，用甲醇稀释成浓度为100”gmL的标准工作液。保存于4。C冰箱中，可使用3个月。4 10标准系列工作溶液：分别吸取一定量的混合标准T作液(49)，用乙腈水溶液稀释成浓度为50 gg5000LgI，的标准系列工作溶液临用新配。4 11 C18固相萃取柱：500 mg3mL。4 12 0盐酸葡萄糖醛苷酶芳基硫酸酯酶：100 000 UmL。5仪器和设备5 1液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾电离源。1农业部1063号公告一220085 2离心机：最大转速6 000 rrain或以上。5 3固相萃取装置。5 4旋涡混合器。5 5分析天平：感量0000 01 g。56离心管：10mL。57氮
6、吹仪。5 8 pH计。5 9移液器：量程20 pL200 pL，100 pL1 000 pL。5 10培养箱。6测定步骤6 1试样制备供试样品置于一18。C以下冷冻保存，使用前放至室温，如有混浊，离心后取上清液备用。6 2试样净化取试样50 mL，置于10 mL离心管中，用20 molL盐酸溶液(43)或20 molL氢氧化钠溶液(44)调节pH至7001，加人口一盐酸葡萄糖醛苷酶芳基硫酸酯酶(412)50 pI。，370。C05。C下酶解16 h，取出冷却至室温后，于6 000 rrain离心5 min，取上清液为备用液。用5mL甲醇和5mL水依次润洗C-s固相萃取柱(411)，取备用液过柱
7、，控制流速在10mI。rain以下，用淋洗液(45)5 mL淋洗柱子，抽干3 min，用8 mL甲醇洗脱收集，40氮气吹干，加入050 mL乙腈一水溶液(46)溶解，过022“m微孔滤膜，上机测定。7液相色谱一串联质谱法测定7 1液相色谱条件7 1 1 色谱柱：c-s柱，150 mmX21 mm，粒径35“；或其他效果等同的C。e柱。712柱温：33。713进样量：20“L。7 1 4流动相、流速及梯度洗脱条件见表1(根据使用仪器及色谱柱适当调整)。表1 流动相、流速及梯度洗脱条件时间 流速 乙腈 01甲酸溶液mln mLmin 0 0 025 52 483 O 0 25 52 4840 02
8、5 90 10130 0 25 90 1013 01 025 52 487 2质谱条件a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子模式；c)检测方式：多反应监测；d)脱溶剂气、锥孔气均为高纯氮气，碰撞气为高纯氩气，使用前应调节各气体流量，以使质谱灵敏2农业部1 063号公告一22008度达到检测要求；e) 毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最佳灵敏度；f) 定性离子对、定量离子对、保留时间及对应的锥孔电压和碰撞能量参考值见表2。表2 10种同化激素的定性、定量离子对、保留时间、锥孔电压、碰撞电压参考值保留时间 定性离子对 定量离子对 锥孔电压 碰撞能量药物名称V eV271o19
9、91 27群勃龙4 28 271 0253 1 4627102531 20287 11211 15去氢睾酮447 28711211 3228711351 2427521091 25诺龙 4 91 27521091 3127521451 20289o96 9 25皇酮 570 289o1089 36289 o1089 233012121 1 28大力补 51430l 21211 32301 22832 11303 3969 26甲基睾酮 6 83 303 31089 3630331089 243293811 48康力龙547 3293811 52329 3121 1 3834522711 27丙
10、酸睾酮12oo 3452109o 32345 2109 o 2233171092 26丙酸诺龙11 39 33171092 42331 7145 1 28315 197o 22孕酮 977 315 197 o 36315 1109o 227 3定性测定在相同试验条件下，样品中待测物质保留时间的偏差小于或等于标准溶液保留时间的25，并且非定量离子对与定量离子对色谱峰面积与相应对照品比值的相对偏差满足表3的规定，则可判定为样品中存在该药物残留，在上述色谱条件下10种同化激素的标准溶液的色谱图见附录A。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差()相对离子丰度 50 2050 1020 10允许的最大
11、偏差 20 土25 土30 土507 4定量测定在仪器最佳工作条件下，混合标准工作液与试样交替进样，采用空白基质标准溶液校正，外标法定量。7 5平行试验按上述步骤，对同一样品进行平行试验测定。8结果计算试样中药物含量(x)以质量分数表示(“gL)，用公式(1)计算：x,c，会毪丽1 000(1)式中：农业部1063号公告一22008x。样品中被测激素药物的残留量，单位为微克每升(gI，)；c，基质标准溶液中对应激素药物的浓度，单位为微克每升(“gL)A试样溶液中被测激素类药物的峰面积；A基质标准溶液中对应激素药物的峰面积；V-试样溶液所代表样品的体积，单位为毫升(mL)；v2样品终定容的体积，
12、单位为毫升(mL)。9精密度在重复性条件下，获得两次独立测定结果的相对偏差应不大于20。农业部1063号公告一22008附录A(资料性附录)10种同化激素标准品的液相色谱一串联质谱图(MRM图)煳，2 4；8 “mM0“a2n7n12els 5E31S+j 5 62e3要i+；，；+3；。耋!呈，；，+，。，一0-8000423。32 4、91 “m18曲a：n，nse蟊ls E器S+耋tl一一一ES+09 217e3搿，2 12吣 2“扪2曲a345nnel2sE109S+-I 17“一2jTr广广_，TT丁r_f_rTl_rrll_广TT_广_TT_厂呷呷丁；一|_，；LS=；厅呷T呷干甲
13、甲广吁彳T。ne2 50 5 00 7 50 10 00 12 50 15 00从上至下依次为：群勃龙、诺龙、去氢睾酮、睾酮、大力补、甲基睾酮、康力龙、孕酮、阿酸诺龙、阿酸睾酮)图A 1 10种同化激素标准溶液(50 IgL)的MRM图墓虽。之农业部1063号公告一22008附录B(资料性附录)10种同化激素中英文对照列表表1 10种同化激素中英文对照列表序号 组 分 分子式 (：ASNo1 睾酮Testosterone，17B TS C19H28q 481 30 12 甲基睾酮Methyltestosterone，MTS (=2。H”Q 581843 丙酸睾酮Testosterone pro
14、pionate，PTS G。Hq 5785 24 去氢睾酮Boldenone，IN)I clgH26(X 846 48 05 康力龙Stanozol01STA 匕J H32N2() 10418 03 86 群勃龙Trenbolone，TRE Cl 8H22q 101613387 丙酸诺龙Nandrolone propionate，PN C2，Hm(X 7207 92 38 大力补MetbarLdrosterLoloae，DIA 【H28q 72 63 09 诺龙19 Nortestosterone，17pNT C18H26q 43422010 孕酮Progesterone，PC- GlH(X 57 83 O
