1、ICS 67040X 00中华 人民共和 国国家标准农业部1025号公告一72008动物性食 品中 磺胺类药物残留检测酶联免疫吸附法Determination of sulfonamides residues in animal originated foodELISA method20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布刖 昌农业部1025号公告一72008本标准由中华人民共和国农业部提出和归口。本标准起草单位：中国农业大学动物医学院。本标准主要起草人：沈建忠、张素霞、何方洋、万宇平、丁双阳、史为民、冯才伟。本标准系首次发布的国家标准。I农业部1 025号公告一72
2、008动物性食品中磺胺类药物残留检测酶联免疫吸附法1范围本标准规定了动物性食品中磺胺类药物残留量检测的制样和酶联免疫吸附快速检测方法。本标准适用于猪肌肉、猪肝脏、鸡肌肉、鸡肝脏和鸡蛋中磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和实验方法3制样31样品的制备取新鲜或解冻的空白或供试动
3、物组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。取鸡蛋去除壳后用均质器500 rmin匀浆20 s，使蛋清和蛋黄充分混合。3 2样品的保存一20冰箱中贮存备用。4测定方法41方法原理或提要基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定。酶标板的微孔包被有偶联抗原，加标准品或待测样品，再加磺胺类药物单克隆抗体和酶标记物。包被抗原与加入的标准品或待测样品竞争抗体，酶标记物与抗体结合。通过洗涤除去游离的抗原、抗体及抗原抗体复合物。加入底物液，使结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加终止液，在450 nm处测定吸光度值，吸光度值与试样中磺胺类药物浓度的自然对数成反比。4 2试剂和材料以下所有试剂，均为分析纯试剂；水
4、为符合GBT 6682规定的二级水。421乙腈42 2正己烷423十二水合磷酸氢二钠424二水合磷酸二氢钾4 2 5氯化钠426氯化钾427磺胺类药物快速检测试剂盒28保存。农业部1 025号公告一720084 2 71系列标准工作溶液0“gL、1 pgL、3 pgL、9 pgL、27 pgL、81 tgL。4 2 7 2包被有磺胺类药物偶联抗原的96孔板12条8孔。4 2 7 3磺胺类药物抗体工作液4 2 7 4酶标记物工作液4 2 7 5底物液A液4 2 7 6底物液B液4 2 7 7终止液4 2 7 8 20倍浓缩洗涤液4279 20倍浓缩缓冲液4 2 8洗涤工作液用水将20倍浓缩洗涤液
5、按1：19体积比进行稀释(1份20倍浓缩洗涤液+19份水)，用于酶标板的洗涤。2c8保存，有效期1个月。4 29缓冲工作液用水将20倍浓缩缓冲液按1：19体积比进行稀释(1份20倍浓缩缓冲液+19份水)，用于酶标板的洗涤。2C8保存，有效期1个月。4 3仪器和设备4 3 1酶标仪配备450 nm滤光片。43 2氮气吹干装置4 3 3均质器4 3 4振荡器43 5离心机4 3 6天平感量oOl g4 3 7微量移液器单道20肚L200 pL、100 pL1 000 pL；多道250 pL。4 4试料的制备试料的制备包括：一取制备后的供试样品，作为供试试料。取制备后的空白样品，作为空白试料。取制备
6、后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。45测定步骤4 5 1前处理过程称取试料2 g-o02 g于50 mL离心管中，加乙腈8 mL，振荡20 rain，4 000 rmin离心5 min：分取上清液25mL于10mI离心管中，于50水浴下氮气吹干；加正己烷1mL，涡动20 s溶解残留物，再加缓冲液工作液1 mL，涡动1 rain，4 000 rmin离心10 rain，取下层水相20 pL分析。4 5 2测定452 1使用前将试剂盒于室温(1925)下放置1 h2 h。2农业部1 025号公告一720084 5 2 2每个标准溶液和试样溶液按两个或两个以上平行计算，将所需数目
7、的酶标板条插入板架。t5 2 3加系列标准溶液或试样液20止于对应的微孔中，随即加酶标记物工作液50“L孔，再加磺胺类药物抗体工作液80 ttL$L，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，置25。C避光反应60 min。4524倒出iL中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，加洗涤工作液250tLL孔，5 s后倒掉孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中液体。再加洗涤工作液250#L孔，重复操作两遍以上(或用洗板机洗涤)。4 5 2 5加底物液A液和B液各50“L孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，室温下避光反应30min。4526加终止液50“L孔，轻轻振荡混匀，置酶
8、标仪于450 nm波长处测量吸光度值。453结果判定和表述用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算。见式(1)：乜相对吸光度值()一芋100(1) u0式中：B标准(试样)溶液的吸光度值；B。空白(浓度为0标准溶液)的吸光度值。将计算的相对吸光度值()对应磺胺类药物标准品浓度(ttgL)的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出。方法筛选结果为阳性的样品，需要用确证方法确证。5交叉反应率表1交叉反应竞争物 交叉反应率()磺胺二甲嘧啶 lOO磺胺二甲氧嘧啶 23磺胺甲基嘧啶 12磺胺嘧啶 1磺胺甲基异觳唑 1磺胺噻唑 1磺胺吡啶 1磺胺喹毅啉 1磺胺间甲氧嘧啶 16检测方法灵敏度、准确度、精密度61灵敏度本方法在猪肌肉、猪肝脏、鸡肌肉、鸡肝脏和鸡蛋样品中的检测限均为20#gkg。62准确度本方法在lO tzgkg50zgkg的空白添加回收率范围为60120。63精密度本方法的批内变异系数20，批间变异系数30。
