1、ICS 65. 020. 30 B 44 GB 中华人民共和国国家标准dEE 4llnHU 4lnunu nunuL nHUn/一ny一?-7AH户hv41t户。户hv户hu4l，nJ内/n/nuvnudnudnHdnHUanME A斗A斗nt叮lAEE,ABEt-JV 干中4E，nRUAAAA吁户hu户hunkuphunJn/nJnJ nudn叫JvnHdnwdAH.an-AAAAIda-aESEAt-,AEE TTTT JffJ/fJ/JIf BBBB GGGG 实验动物微生物学检测方法(2)Laboratory animal一-Microbiological examination -m
2、ethods 2001 - 08 -29发布2002 - 05 -01实施中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局发布GB/ T 14926.1 0-2001 34 前本标准是对GB/T14926.10-1994(实验动物泰泽氏菌检验方法的修订。本标准增加了ELISA和IFA法作为初步检测的选用方法。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:李红。本标准于1994年1月首次发布。中华人民共和国国家标准实验动物泰泽病原体检测方法G/ T 14926. 102001 Laboratory animalMethod for examination
3、of Tyzzers organism 代替GB/T14926. 10- 1994 1 范围本标准规定了实验动物泰泽病原体的检测方法。本标准适用于小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和兔泰泽菌的检测。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/ T 14926.42一2001实验动物细菌学检测标本采集GB/ T 14926. 432001 实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂GB/ T 14926. 502001 实验动物酶联免疫吸附试验GB/ T 14926. 52
4、2001 实验动物免疫荧光试验3 原理病原体寄居于动物回盲部粘膜细胞内，当动物处于应激状态或免疫力低下时可导致出血性坏死性肠炎或(和)肝脏点状坏死，该病原体具有特殊的菌体形态和排列方式，据此可进行检测。动物感染泰泽病原体后血清中可产生相应的抗体。根据免疫学原理，采用泰泽病原体抗原检测小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔血清中泰泽病原体抗体。4 主要设备和材料4. 1 普通恒温培养箱。4. 2 荧光显微镜。4. 3 生物显微镜。4. 4 酶标仪。4. 5 组织研磨器。4. 6 超声波细胞破碎机。4. 7 聚苯乙烯板，40孔、55孔或96孔(可拆或不可拆)，用前洗净晾干，紫外光照射1h。4. 8 微量加样器
5、，容量550L、50200L。4. 9 印有1040个小孔的载玻片。4. 10 盖玻片。4. 11 超低瘟冰箱或液氮罐(保存肝脏用)。中华人民共和国国家质量监督检验检瘟总局2001-08 -29批准2002 - 05 -01实施35 5 培养基和试剂5. 1 血琼脂平皿。5.2 乙酸可的松注射液。5. 3 甲醇。5. 4 姬姆萨染液。5. 5 ELISA抗原。5.5. 1 特异性抗原GB/ T 14926.10 2001 带有严重坏死灶的动物肝脏用PBS制成1: 10的匀浆，超声波粉碎后离心，取上清液作抗原。5. 5. 2 正常抗原未受泰泽菌感染的动物肝脏，按4.5.1法制成。5.6 抗原片5
6、.6.1 抗原带有严重坏死灶的动物肝组织用PBS按1: 10在冰浴中制成匀浆，调整浓度至每个显微镜镜泊视野有适当的菌量，即细菌、肝细胞、细胞碎片完全铺开，不重叠。泰泽菌自溶现象严重，应尽快完成该过程。5. 6.2 抗原片制备将上述抗原液适量滴于玻片孔中，室温干燥后，冷丙酣(4C)固定10mino PBS漂洗后充分干燥，置于一20C备用。5. 7 酶结合物辣根过氧化物酶标记羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠IgG抗体，用于检测相应动物的血清抗体;辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体，用于检测兔血清抗体;辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A(SPA) ，用于检测小鼠、豚鼠、兔血清抗体。5. 8 荧光结合物荧
7、光标记羊或小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠IgG抗体，用于检测相应动物的血清抗体;荧光标记羊抗兔IgG抗体，用于检测兔血清抗体。5.9 阳性血清上述抗原免疫清洁或SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠或无泰泽菌感染兔获得的抗血清。5.10 阴性血清清洁或SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠血清;或无泰泽菌感染的兔血清。5. 11 50%甘油PBS5.12 其他试剂溶液的配制见GB/T14926.50一2001和GB/T14926.52-2001。6 检测方法6. 1 可的松诱发试验6. 1. 1 检测程序36 GB/ T 14926.10- 2001 6. 1. 2 操作步骤6. 1. 2.1 可的松注射四周龄动物按20
8、0mg/kg皮下注射醋酸可的松，每日一次，共注射35d，每日观察。6.1.2.2 剖检动物动物出现萎靡、食欲不振或腹泻后进行麻醉、解剖。如有肝脏有弥漫性点状坏死，作肝压印、肝匀浆涂片并接种血平皿;有血性腹泻或回盲部水肿充血或出血性肠坏死者取病变组织用PBS(pH7.2)轻柔漂洗后制成匀浆涂片。6.1.2.3 染色压印片和匀浆涂片风干后用甲醇固定5min，姬姆萨染色，油镜镜检。带有点状坏死的肝切面接种血平皿，(36士l).C培养48h，确定有无细菌生长。6.1.2.4 结果判断用油镜观察肝压印片或肝匀浆涂片时应能看到紫色、短的毛发状、成堆、与细胞同在的细菌，部分菌株可形成芽抱，而血琼脂平皿培养呈
9、阴性者可作出阳性判断。6. 2 酶联免疫吸附试验(ELISA)6.2.1 包被抗原根据滴定的最适工作浓度，将特异性抗原和正常抗原分别用包被液稀释，每孔100L，置37.C1 h 37 G/ T 14926. 10 2001 后再4C过夜。6.2.2 用洗涤液洗5次，每次3min，叩干。6.2.3 加样待检血清和阴性、阳性血清分别用稀释液做1: 40稀释，分别加入两孔(特异性抗原孔和正常抗原子L)，每孔100L，3TC1 h，洗涤同上。6.2. 4 加酶结合物用稀释液将酶结合物稀释成适当浓度，每孔加入100L，37C1 h，洗涤同上。6.2. 5 加底物溶液每孔加入新配制的底物溶液100L，置3
10、TC，避光显色10-15min。6.2.6 终止反应每孔加入终止液50L。6.2.7测A值在酶标仪上，于490nm处读出各孔A值。6.2.8 结果判定在阴性和阳性血清对照成立的条件下，进行结果判定。6.2.8. 1 同时符合下列3个条件者，判为阳性。对阳性结果需重试，如为阳性则判为阳性。a)待检血清与正常抗原和特异性抗原反应有明显的颜色区别;b)待检血清与特异性抗原反应的A值二三0.2;c)待检血清与特异性抗原反应的A值/阴性对照血清与特异性抗原反应的A值注2.1。6. 2.8.2 均不符合上述3个条件者，判为阴性。6.2. 8. 3 仅有1-2条符合者，判为可疑，需重试。6. 3 免疫荧光试
11、验(lFA)6.3. 1 取出抗原片，室温干燥后，将适当稀释的待检血清和阴性、阳性血渭分别滴于抗原片上，每张玻片上应分别有阳性和阴性血清各1孔，置湿盒内，3TC30-45 min。6.3.2 PBS洗三次，每次5min，室温干燥。6.3.3 取适当稀释的荧光结合物，滴加于抗原片上，置温盒内，37C30-45 min o 6.3.4 PBS洗三次，每次5min。6. 3. 5 50%甘油PBS封片，荧光显微镜下用油镜观察。6. 3. 6 结果判定:阳性血清孔菌体荧光着色强;待检血清孔较阴性血清孔菌体荧光着色强，即可判断为阳性反应。7 结果报告对ELISA法和IFA法判定为阳性的动物群，应立即对同
12、一动物群抽样进行可的松诱发试验，符合该可的松诱发试验检测结果者作出阳性报告，否则作出阴性报告。38 FCON-导.N叮!叮叮.Nm叮CON-5.N叮俨问筒。OONi止.N叮!.N叮FCON-.N白叮!二N叮俨同阁。同阁。同阁。华人民共和国家标准实验动物微生物学检测方法(2)GB/T 14926.1-14926.6-2001 GB/T 14926.8-14926.17 2001 国中GB/T 14926.41-2叫01GB/T 14926.44-14926.49 2001 中国标准出版社出版北京复兴门外三里洞北街16号邮政编码:100045电话:68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售68517548 普* 印张6字数180千字2002年2月第一次印刷开本880X12301/16 2002年2月第一版印数1-2000峰7巳定价45.00网址书号:155066 1-18097 也略595-547 版权专有侵权必究举报电话;(010)68533533科目GB/T 14926. 1-2001 H
