DB11 T 376-2006 养殖鱼类病害防疫检疫技术规范.pdf

1、 ICS 65.150 B 50 备案号： 19167-2006 北 京 市 地 方 标 准 DB DB11/T 376 2006 养殖鱼类病害防疫检疫技术规范 Rules of epidemic quarantining and prevention for familiar disease of cultured fish 2006-07-25发布 2006-10-01实施 北京市质量技术监督局 发布 DB11/T 3762006 I 前 言 本标准为常见鱼病防疫检疫技术操作规程。 本标准由北京市农业局提出并归口。 本标准起草单位：北京市农业局水产办公室。 本标准主要起草人：李继勋、杨华莲

2、。 DB11/T 3762006 1 养殖鱼类病害防疫检疫技术规范 1 范围 本标准规定了常见养殖鱼类的病害防疫检疫技术操作规范。 本标准适用于北京地区淡水养殖鱼类疾病的防疫检疫和管理。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包 括勘误 的内容）或 修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准 达成协议的各方研究 是否可使 用这些文件的 最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版 本适用于本标准。 GB ll607 渔 业水质标准 GB/T 15805.1-1995 淡水鱼类检疫 方法 第一部分 GB/T 18

3、407.4-2001 农产 品安全质量 无公害水产品 产地 环境 要 求 NY 5070-2002 无 公害 食品 水产 品中渔药残留限量 NY 5072-2002 无 公害 食品 渔 用配合饲料安全限量 NY 5171-2002 无 公害 食品 渔 用药物使用准 则 DB11/T 196-2003 常见鱼病防治技术操作规程 3 防疫调查 3.1 养殖的环境调查 3.1.1 周围环境 根据 GB/T 18407.4要求 的 各项指 标 进行调查。 3.1.2 养殖水源 调查养殖用水 来源和进排 水。 根据 GB 11607各项水 质指 标 调查 水 质的情况。 3.1.3 养殖水体 调查养殖水

4、体形状 、面积 、水 深 、底质及水 化因子情况。 3.2 养鱼史调查 调查养殖鱼类 发生鱼病的病 原 类 型、 发生频率、 药物的使用 情况 （包括药物种类、成 分 、用 量 和施 用次数） 。 调查放 养鱼 苗 、鱼种产地病 史 、检疫和 药物使 用 情况。 3.3 水质监测 3.3.1 气温和水温 采用水 银温度计、酒精摄氏温度计、 电子仪器测量 ， 测 量时要注明当天 的气象情况。 3.3.2 水色和透明度 透明度采 用 透明 度板进行 测量 ，通过 目测观察养殖水 体 的水色以判断浮游 生物的 种 类和 数量。 3.3.3 水体 pH值 采用PH 试纸 、 比色测定计 、电 子 酸度

5、计进行 测定。 3.3.4 溶氧 使用碘 量法测定养殖水体 的溶氧量 。 3.4 化学物质测定 根据GB 11607 要求 的水 质指 标和方法进行分 析 。 3.5 池塘清整方法 3.5.1 清塘方法 DB11/T 3762006 2 调查 清塘消毒 方法（是 干塘清塘消毒法或 带水 清塘消毒 法） 和清塘 程 度 ，包 括淤泥的清理程度、 排水、除杂以 及塘基修 复情况。 3.5.2 清塘消毒药物 根据 NY 5171提 供的 药物进行清塘。 调查内容 包 括 清塘消毒时间 、 各种药剂名称 、用 量、 效果 及消 毒时 的操作方法的 调查。 3.6 饲养管理情况调查 包括饵 料来源、种

6、类、 投喂 方法、水 质 管理和 平时疾病预防方法等内容。 4 病原体的检查 首先确 定检 测 的鱼品种名 ，检 测器官部位、病 变程度 ，所 取 标本的情况， 再通过目检、 显微镜检 查、 病毒学 检测、细菌学检 测检查发病原因和 初步确定病 原体 的 种类。 4.1 检测及分类 4.1.1 目检 根据症 状通过目检 法 初步判断病 因和原病种 类。主要有 寄生 虫病、水 霉 、 原生动物、 蠕虫等； 根据 病鱼的 外表反应初步判断 和辨别病毒 和 细菌性 病原体 。 4.1.2 镜检 采用放 大镜 、 解剖镜、光学显微镜等 检 查法 。 4.1.3 分离、培纯以及感染试验 采用镜 检方法对

7、微 生物 性 病原 、病 毒 、 细菌进行检测 ， 如对微生物 性病原 、病 毒 、 细菌的 细胞 形 态、 培养 特征、生理生化反应等 进行观察 、 测 定， 需要进一步进行分离 、培纯以及 感染 试 验。 4.2 寄生虫类病原体检查 对比较 大的 寄 生虫性病原体 ， 宜 用放大倍数 低的 显微镜 或双筒 解剖镜检查。 4.2.1 玻片下观察 把从器官 或 组织上 分离出的 较 大 的寄生虫直接 放 在小玻璃皿 或 玻片上观察， 对较小 的寄生虫 要 把寄 主的 器官组织或内 含 物 压成薄层后进行观察 。 4.2.2 镜检 4.2.2.1 检鳃 从每一 侧鳃 的 第一片鳃片接近两端 的位

8、置取 鳃组织 。 4.2.2.2 检口腔 先用目 检方法观察 鱼 体表 面确 定有 无吸虫的 大胞 囊、 锚头藻 等， 再用镊子 刮 取上 下颌少许粘液进行 镜检。 4.2.2.3 检体 腔 将鱼腹 剖开 ， 将 器官 暴露 ， 观察脂肪组织、 肝、 胆囊、 脾等有 无肉眼可见的病原体。 如发 现有 白点 ， 可能 是粘孢子虫或 微 孢 子虫。 还可发 现线虫、 绦 虫 、 棘头 虫等 成 虫和 囊蚴 。 目 检完毕后， 把腹腔液用吸 管吸 出，置于培养 皿里进行检查 。 4.2.2.4 检脂肪组织 通过目 检胃肠外壁的脂肪组织， 如果 发 现白点， 肉眼无法 判断时，可 用镊子取出，压片 进

9、行镜检。 4.2.2.5 检胃肠 先把肠 外壁 的 脂肪组织剔净 ， 然后在前肠 (胃 )、中 肠 和后 肠三段上各 取少许， 滴上 生 理 盐水 进行 镜 检。 对寄生部位比 较固定的寄生虫 ， 如 通常 寄生在后 肠近肛门 的位置的六鞭毛 虫、 变 形虫、肠袋 虫等， 通常 寄生在前肠( 胃) 或 中肠的复殖吸 虫 、 绦虫、 线虫和棘头 虫等。 4.2.2.6 检肝 和脾 先目检 肝 、 脾外表颜色和病灶 ，有 无溃烂、病 变 、 白点 和 肿瘤等。 如 有 白点 ， 可 能是 粘 袍子 虫或 者 微袍 子虫 、球虫 。 然 后用 镊子从肝、脾上 取少许组织压片镜 检。 DB11/T 3

10、762006 3 4.2.2.7 检胆囊 把胆囊完 整 取 出后， 放 入培养皿中， 先通过目 检 观察外表 颜色和可疑的疾病 症状， 然后 剪开 ， 放 出 胆汁 ，取一部分胆囊壁 放在载玻片上压片 进行镜检。 4.2.2.8 检心脏 用小剪刀剪开 胸腔， 取下 心脏 ，并 将心脏剪开， 取一滴内 含物 ， 进行 镜 检，检 查 是否有锥体 虫 、 隐 鞭虫等 。同时取心脏组织少许 用玻片压展 法进行镜检。 4.2.2.9 检鳔 取鱼鳔 时保持鳔的完整， 观察其外表 ， 然 后剪开 ，检 查有 无复殖吸虫、 线虫。 同 时取鳔组织少许用 玻片压 展法进行镜 检。 4.2.2.10 检肾脏 把

11、整个肾脏 完 整 地取 出。检查方法 同4.2.2.6 。检查 有 无粘孢 子虫 、 球虫 、 锥 体 虫、 隐鞭虫，复 殖 吸虫 、线虫等幼虫 。 4.2.2.11 检性腺 和膀胱 将左右 两个 性 腺完整取出， 进行目检。没有 膀胱 的鱼， 则检查 输尿 管。 4.2.2.12 检眼 把完整 的鱼 眼 睛放 在玻皿或玻片上， 剖 开 巩膜， 放出玻璃 体和水晶体 ， 进行镜检，检 查 寄生在眼睛 的吸 虫幼虫。严重 感染吸虫时，水晶 体 变 白色， 混浊不透明 ，致 使 鱼眼失明。 4.2.2.13 检脑 按水平 方向， 从后向前 ， 在后脑 和眼 睛之 间剪开头 盖骨 上壁 ， 即见 到

12、充满着淡 灰 色泡沫状的 油脂 物 质，用 吸 管 把它 吸 出， 放 在玻皿里 ， 以备检查。 吸净油 脂物质 后， 灰白 色 的脑即显露 出来 ，用 剪刀把它 完整 地取出来检查 。 4.2.2.14 检脊髓 从头部 与躯 干 交接处把脊柱骨剪 断 ， 再把身体 的 尾部与躯 干交接处的脊柱骨也剪 断，用 镊子从前端 的断 口插入脊髓腔 ， 把 脊髓夹住，慢慢地 把脊髓整条 拉 出来，然 后检 查。 4.2.2.15 检肌肉 从身体 的一 侧 面剖开一部分 皮肤 ，用 镊 子把 皮肤剥去 ， 或用小 棍棒 (玻棒 或 竹棒 )， 象卷 纸筒一样， 慢慢 地把皮肤卷剥 。 剥去皮肤 后，肌

13、肉 即 露出来，经 目 检后， 再 进行 镜检。 4.3 原生 动物病原体的 计数 原生动 物不 同 种类个体大 小差异大， 除纤 毛 虫、 毛 管 虫以显微镜 低倍 视野 为单位 之外 ，其 他 种类如 鞭毛 虫、变形虫、 孢 子 虫均以显微镜 的 高 倍视野为单位。寄 生虫 或 病原体数量 用“十”号表示， “十” 表示 有 ；“ +”表 示多；“+ ” 表示很多。 必 要时可用文 字描述 。 具体表 示法: 在一 个视野里，有（ 1-20） 个虫体记 “十 ” ，（ 21-50） 个虫 体 记 “ +” ， 51个 虫体 以 上记 “+ ” 。 关于胞囊的 计数则用文字说明 。 4.4

14、单 殖吸虫、线 虫、绦虫、棘头虫、甲壳动物和 软 体 动 物幼 虫的计数 在50个 以下 均 以数 字说 明， 50个 以上则说明 估计数字 或 者部分 器官 里 的虫体数 。 4.5 检查 时所 用的显微镜的倍数 显微镜 倍数 都 应注明， 低倍显微镜为 10倍 ； 高 倍 显微镜为 10倍 40倍。 微 型 病原体数量 的计 算 ，是 以同 一玻片中观察 的 平 均数为准。 5 病原体的 收集操作 对需要通过详 细观察其形 态结构才能鉴定和 需要 进一步 研究的病原体 ， 应做好其标本的收集 、 固定 和保 存 。 5.1 病毒 DB11/T 3762006 4 收集病 毒性 病 原体标本

15、， 应 在无 菌 操作下收集 发 病早期的病鱼 带毒最多 的 组织 器官 ， 保证病毒不致 灭活 。 5.1.1 病毒材料 的收集 取出病 变的器官组织置 于 无 菌器 皿中，然后 置于50% 的 磷酸 缓冲甘 油 中。注 明 收集 地 点、日期和寄 主种 类。 实验 室 距现 场 较近 ， 可以直接检测 ， 若实验 室 距现场 较 远， 需把病鱼 或病鱼器官 组织 放 入有冰 块的 保温瓶中，快速运往实 验室。保 存 温度 在-2O 50 。 5.1.2 病毒的分离培养 由于病 毒只 能在 活的组织 细胞 中 繁殖，鱼类病毒 分 离 培 养应 通过组织 培养。 5.1.3 病原悬液 的制备

16、将保存 在50% 缓冲甘 油的标本 (样 品) ，用 无 菌 生理盐水 冲洗 3次， 如是新鲜收集的器官 组织材料 ， 测 量重 量后，用 剪刀剪碎， 按样品重量加入适 当比例的 缓冲 生理 盐水 (比例 为1:10至1:20) ，用 匀浆 器或 乳钵 将样品研成乳 状 ， 以3000 转/min速 度离 心 20min， 吸取 上清液， 按 体积 1ml加入 青霉 素 800国际 单位、 链霉 素800 g，在 30 左右处理2h， 然 后于 5保存备用。 将离心 后的 上 清液，经滤 器过 滤 除菌，滤液 保存 备 用。 5.1.4 鱼体造 病感染 采用注 射或 浸 泡两种方法 ，同 时

17、设对照组观察 。 5.1.4.1 注射 感染 将病原 悬液 配 成一定浓度 ， 从 鱼体腹鳍基 部进行腹腔 注射，用 量 视鱼体的大 小 而定，通常 每 尾注射 0.2ml 0.4ml。注 射 后 放入水族箱中 饲 养， 维持发病水温， 观察 发 病情况。 5.1.4.2 浸泡 感染 将病原 悬液和 无 氯自 来水 稀释 成 一定浓度 ， 将健康鱼放 入其中 浸泡30min 后，移至水 族箱中饲养， 维持 发病水温，连续观察 鱼的发病情况。 5.1.5 细胞培养 与感染 采取组织 培 养的 方法进行 病毒 的 分离、 培 养， 制备 纯净 的病 毒抗原，通过 血清学试验 (如 中和试验) 与感

18、染 细胞的特异 变 化来进行 病毒的 鉴 定和 抗血清效 价 的滴 定等 。 5.1.6 原代细胞 培养 选择健康 鱼， 在 无菌 操作下解剖，取 出 组织 ，置 于 盛 有 EarIe氏平 衡 盐溶 液的无菌培 养皿中，用镊 子小 心除去 附着 的 组织 和血块，然后移入瓶 中，用Earle 氏 液洗 涤2 次 ，将组织 剪碎 ，成为 约 lmm大小的 组织 块，再 用Earle 氏 液洗1 次 ，加入相当于 组织量10 倍 (约 1份 组织 加 入9 份胰酶 )的25% 的 胰酶 ， 在 25 消化 20min 30min， 消 化完毕 ， 弃去胰酶液，用 Earle氏液 清洗2 次， 然

19、 后加 入 Eagles生长液 (Eagles 液加 入10% 小 牛 血清、 青 霉 素100 单位 /ml、 链 霉素 100g /ml ，用 5%NaHCO3， 调 节 pH7.27.4) ，用 吸管 反复 吸吹 ， 以 助细胞分散 ， 静 置片 刻 ， 让没有 分 散 的 大颗粒沉 下， 然后 吸 取上层的细胞 悬 液 ， 稀释 成 100 万单位 /ml的 浓 度， 接 种 入培养瓶( 若采 用 青霉 素瓶 作培养瓶， 则每 瓶 分装 1毫升 即可) ， 盖紧瓶塞， 置 温 箱内 (温水性鱼类 可 在 22 28 )培养。 每隔 3d4d更换 培养液 1次 ， 逐日 在 显微镜下观察

20、细胞 生长情 况。 Earle氏溶液配方见附 录A 。 5.1.7 病毒接种 选取生 长均匀 的单 层 细胞培养物 ，在无菌操作下， 吸 出细胞 瓶 内旧的培养液 ，以Earle 氏液清洗细 胞 1次 ， 然 后 接 种 入 上 述制 备 好 的病 原 悬 液 (青 霉素瓶 可 接 种 0.2ml 0.4ml)， 在 28 吸 附 30min 60min， 然后弃去瓶内 的病原悬液 ，加 入与 原来培养液等体积 的 维持 液 (即 Eagle液含 2% 6%小牛 血清 、 青霉 素100 单位/ml 、 链 霉素100 g /ml，pH 7.2 7.4)，置 于28的条件下培 养，在显微镜 下

21、 逐 日观察 细胞 病变 。 不同病 毒应 按 照不 同 的病 毒接 种方法进行 。 5.1.8 病毒株 的保存 5.1.8.1 低温 冷冻保存 DB11/T 3762006 5 若 在短 期 内使 用 , 应 将含 有病 毒的 细胞培 养液或 含有病 毒的组织 器官 暂时保 存于 -20 -80的 低温 冰箱或液氮中。材 料应贴好标签 ，注明毒株名称 、 代数及 日期。 5.1.8.2 真空干燥保存 长期保 存病 毒 活力可采用 真空 干 燥方法。 但应 使 用适宜的保 护剂制备病 毒 的悬 液， 保护剂有正常灭 活血 清、卵白和卵黄 、 蔗糖饱和液等 。 5.2 细菌 5.2.1 细菌类病

22、原体标 本 的 收集 取得病鱼标本后， 应 立 即送往实验室 进行分离。 在野外调查 的流动条件下， 或离 实 验室 较远， 可采 用如 下方法将病鱼标本 暂时保存。 冰块 法 将 病鱼 (要取未死 或 刚死 的病鱼) 放入 盛 有 冰块 的瓶 里， 然 后送 实 验室 进行 病 原菌 分 离 。 棉拭子 法 如果 是血液 或分 泌 物 等， 宜采 用 棉花团擦抹患 病的部 位，然 后 将抹 有病 患 部位 含 有 物的棉拭子 送往实验室。 5.2.2 分离培养 用浸过 70%酒精 的 纱布覆 盖 病鱼 体表 ， 进行 鱼体 表 面 消毒 后， 取少许病灶 部位组织， 接种 于适 当的 培养

23、基使之生长， 或 直接在固 体平板培养 基中划线分 离 。分 离后 挑 选单个菌落 进行 培 养。 5.2.2.1 分离 内部器官 如肠、 肝、 肾 等则用无菌 手术 法 剖开腹部后，用灼热铁 片烫后 再 用接 种环取出进行材料分 离。 5.2.3 采心血 在心房 处烫 过的 部 位， 以 无菌 接 种针刺入， 然后 接 种 在 培养基 上 进行分 离 。 5.2.4 人工感染试验 人工感染 的 接 种方法有浸 泡 、口 服 、注 射、 涂抹等。 例如 鱼体表面的病 症 可采 用浸泡、口 服 、注 射 等方法 。 多次反复试 验 (包括 再 分 离再感染) 后， 根据其出现的病 症 ， 判断所

24、 分 离的 细菌是否具有致病 性， 并根据 菌落形态和 培 养 特征、生理生化反应测 定病菌 的 分类位 置 和 名称。 5.3 水生 真菌 对真菌菌 丝 体 外部形态特征 进行目检，初步判断真 菌 病 原体种 类。通过实验室培 养， 鉴 定其种类。 5.3.1 培养方法 采用培 养基 ，通过水 生真 菌的 无 性繁殖，使 它的 孢 子 以 及菌丝 在 培养 基上长成新 的 菌丝 体 。 5.3.1.1 大麻子 仁或大麦等 制作培养基 : 将大麻 子仁煮沸消毒后， 选取 吸水饱满的 大 麻子 仁2 粒 3粒 ， 放 入盛有无菌 水的 培 养皿里 ，并 使 每 粒大 麻子仁互相间 隔 有 一定距

25、离， 以利 菌丝充分生 长 。 如果 没 有 大麻子仁， 可用 大麦、 小 麦或 糯谷代替。 5.3.1.2 鸡蛋黄 制作培养 基 将鸡蛋 煮熟 后， 取 蛋 黄 ， 放入已消毒 的 烧杯 中， 盖 上 盖子 ， 取 米粒 大 小的 蛋 黄粒， 置 于盛有无菌 水 的培 养皿里。 5.3.1.3 动物 尸体制作培养 基 将动物 尸体 用 蒸馏水冲洗 数次 后， 在解剖镜下选 取 所需要的 部位， 置于盛有 无 菌 水的培养皿中。 如 苍蝇 以及各种水生 昆 虫 的腹部和附肢 ， 都 可作为培养 基 。 5.3.1.4 鱼卵 制作培养基 取各种 鱼卵 ，用 60 80的热 水浸 泡 10min，

26、使鱼 卵 失去 活力， 然 后取 出放入盛有 无菌水的培养 皿中 备用。消毒处 理后可作为水生真 菌 的 培养基。 5.3.2 接种法 按生物 学规定的接种法进行 操作。 6 病原体标 本的保存操作 DB11/T 3762006 6 6.1 培养 基保存法 在菌种 较少 又 经常使用时 ， 保持 其条件不 变者 可采 用此法。由于 培养基的 物 理化 学性质因细菌的代 谢而 发生变化， 影响 细菌 的 性 状，而 且操作麻 烦 ， 需 要不 断地 多 次传 代。 因此 ， 此法不作为长期 保存之 用。 6.2 冷冻真空干燥保存 法 在各种 保存 菌 种的方法中，以 冷冻 干 燥法最 为理 想。

27、在 冷冻状 态 下干 燥和在真空 状 态下 封闭保存， 使菌 种失去代谢所 必 需 的水分 ， 构成保持细菌 长 久 不 变的 良好 条件， 可 避免保 存过程中影响菌种 的性状 和因 操作造成的污 染 和 变异。 此法可 长 期 保存菌种。 6.3 水生 真菌 类的保存 6.3.1 水霉 从感染 水霉 的病鱼病 灶上 取下水霉的部分菌 丝，用5% 的 福尔马林保存。 6.3.2 鳃霉 用盖片 涂抹法涂片，用5% 福尔马林保 存 患鳃 霉病的部分鳃组织 。 6.4 原生 动物的保存 6.4.1 涂片法 盖 片涂抹 法: 适用于所有的 微 小寄 生虫。 干 涂片和 湿 涂法：适用于 体 液 中或

28、 血液中的原生动物。 血 液涂片 法 ：用 微吸 管 吸取 一 小滴 血液 ，置于 约 占载玻片 长度 3/4的位 置上 ， 右手 握 着同样 大 小的另 一 块 载玻片 ， 一端与 放 有 血滴 的 载玻片上的血滴前 面接 触，而 与 平 置桌 面上 的 载血玻 片 约成 40度角倾斜 ， 然 后将血滴向 前轻轻地推 移 。 干 片 制备 法 ：不通过 固 定液固 定， 让 材料在 空气中 干燥 后，再进行 染色 。采用 硝 酸银法 染色 后， 可观察斜 管虫的腹部纤 毛线，小瓜虫、肠袋虫等的纤 毛线 ，车轮 虫的 齿 环等结构 。 6.4.2 70% 酒精或 4%福尔马林浸泡 法 用浓度

29、为70% 酒精 或浓度为4% 福尔马林浸泡固定鱼体病变器官 或组织 。 6.5 蠕 虫类 蠕虫类包 括单殖吸 虫 、复 殖吸虫、绦 虫 、线 虫、棘头 虫 、环节 动 物 等类群。 6.5.1 单殖吸 虫 用2 根解剖 针( 最好 竹针) ， 在 解剖镜 下将粘附在鳃片上 的虫 体挑出， 再用 吸 管 吸取 ， 置于盛有清 水 的玻皿里，用甘 油 、4%福尔马林或聚乙烯醇 把虫体封 固。 6.5.2 复殖吸 虫 复殖吸 虫的成虫， 大多 数寄生在鱼 体 的消 化道 内 。 收集标本 时 ， 将鱼的消化 道剪开 ，用 解剖 刀轻轻 刮下 肠壁的内含物及肠粘液 ， 放入 培养 皿 ， 加入 生 理

30、 盐水 进行 搅拌 后，用 吸管吸 去混浊的水， 再 重新加 入新 水，连续更换 数次 ，直至澄清 ， 然 后 在解剖镜下检查， 逐一 把 虫体吸出。 标本固 定前， 应 把粘附在虫 体上 的 粘液和组织 碎片 冲洗干净 。用 吸管冲洗时 ，防 止吸 管把 寄 生虫带 到另 一个培养皿中 去 。 复殖吸 虫的固定， 应 使虫 体尽量伸展 而 又不 致虫体破裂。 6.5.3 绦虫 首先把 虫体从组织 或 器官 中取出。 固 定前， 应 把虫体置于水 里 ， 待虫 体 充分 伸展时， 再 把虫 体压在 两块 玻片之间，保 存 在 70%的酒精里 。 6.5.4 线虫 将 收集 到的线 虫标本 放在

31、 盛 有 生理 盐 水的 玻璃 试 管中适 当地 摇 动， 将 虫 体上 的 污物 洗净后 再行 固 定。 6.5.5 棘头虫 棘头虫 的固定和保 存 方法 与复殖吸虫 相 似。 应使吻部 伸 出后进行固 定。 DB11/T 3762006 7 6.6 软 体动物 (钩介幼 虫) 和甲壳动物类 6.6.1 钩介幼 虫 宜用70% 酒精固 定保存 。 6.6.2 甲壳动 物 寄生在 鱼的体表 ， 虫体 较大。 可用70% 酒精或3% 4%的福尔马林 溶 液固 定， 保 存在 70%酒精中。 组织 切片 标本则用葡翁 氏 液固 定。葡翁氏 液 配方 见附录B 。 6.6.3 藻类等 水生植物 水生

32、植 物中的藻类，如青 泥苔、水网 藻 等，可放入盛 有 4%福尔马林 的标本瓶里固 定 保 存。 采集到 的水生植物 和水草标本， 可 以选择 较完 整( 有 花 、 果 实和枝叶 )的植株 ，用草 纸 或适 当 的吸水 纸压 制成干标本保 存 。 植物体尽可 能按 照 它的 生 活状态， 摆在压 制 纸 上 ， 上 面再 盖上压制纸 ， 夹 在压 制 板内 。 6.6.4 水生昆 虫及较大的水生敌 害动物等 用10% 福尔马林 固定和保存。 7 病原体的 鉴定 7.1 病毒 7.1.1 用光学 显微镜检查 鉴 定 制成涂 片、压片、或 石蜡切 片等进行 检 查。包 括用吉姆萨 （ Giems

33、a）染色法等染 色 检 查。 7.1.2 电子显微 镜法检查 鉴 定 染色方法 与细胞学 的 染色 方法相同。 染 色后 采 用电子显微镜 检查，用 微观 照相 或 摄像 对 检查 过程 进 行拍 照。 7.1.3 利用血 清学诊断鉴 定 采用中和 试验对鱼类病毒 传染病进行 血 清学 诊断 。 在培养的 组织细胞或 鱼 体 中， 将毒 悬 液与 抗血清 按比 例混合中和， 然 后 将病毒、 血清 混 合 接种 于寄主 系统 ， 测定病毒的感染力 和抗血清的效价 。 7.1.4 利用聚合酶链反应（ PCR）技术诊断鉴 定 PCR技术具 有高度 敏感性 和特异 性，能将 微量 的特定 DNA片段

34、在 数小时 内特异 地快速 扩增 至 数百 万 倍， 快速省 时 ， 广泛 应 用于DNA 和 RNA检测， 在病毒感染的诊断 中， PCR技术可 检 测 出正在 增 殖和 潜伏的 病毒 ，也可诊断不 能 或 难于在体外培 养的病毒。具体 操作 按 照仪器用法指导进行。 7.1.5 利用酶联免 疫吸附 测定法 （ ELISA）诊断鉴定 ELISA方法 是在 酶 的催 化作用下使原来的 底物发生水 解 、氧 化或其 它 反应 ， 生 成有 色 产物，可进行 定性 或半定量分析。 或 用分光光度计进行进一 步分析 。 7.1.6 琼脂扩散 试验 7.1.6.1 双相琼 脂扩散法 置室温 下作用 2

35、4h，观察 结 果 。如抗 原 抗 体两孔 出 现 清 晰的 白色沉 淀 线， 则为 阳 性反应 ， 无 沉淀线 为阴 性反应。 7.1.6.2 单相琼 脂扩散法 配成3% 琼脂， 再 与等 量的 抗血 清 混合 ，即成 1.5%琼 脂 。然 后打孔，孔距 5到10mm，向 孔内加入较 浓 的抗 原液， 也 可 做不 同 稀释 度， 抗原量使之与 琼 脂 板 相平 即可。 然后平置室温 5min-15min， 观察结 果 。 孔周围 出现乳白色 沉 淀 环的为阳性 。 7.1.7 荧光抗 体技术 预先制 备好 荧 光抗体 ，可 以在 24h内 获得诊断结果，具体准 备工 作和操作 方法 按照

36、有 关指导进行。 荧光抗 体活 性测 定 方法 按 一般 血 清学 方法 ， 如 抗 球蛋白荧光 抗体可用环状沉淀 试验测其效 价 ； 抗病 毒荧 光抗体可用补 体 结 合试验测其效 价 ； 抗细菌荧光 抗 体可 用凝 集 试验测其效 价 。 7.2 细菌 DB11/T 3762006 8 在显微镜 下 观察细菌 的大 小、 形状 、细胞排 列、有无 荚 膜和芽 孢 、有 无鞭毛、鞭毛的数 目及排列、 革兰 氏染色反应、 培 养和 菌落的特征 等 ， 初步鉴定细菌的类 型。 根据细菌 的 具 体类型，按 照细菌检测 的 指导 方法 ， 进一步鉴定其具体种 类。 7.3 水生 真菌 类 通过光学

37、显微镜观察 其活 体的 形 态结构或经 福尔马林 (或酒精 )等溶 液 浸泡保存的标本， 可鉴 定其 种 类。 根据动 孢子 囊 的产生方式 、形状、位 置 ，以 及产 生 的 动 孢子数量、形状 、鞭毛着 生 和发 育情况等， 可以 区分出各个属 。 7.4 藻 类及寄生虫 除观察 其活 体 标本外 ，其 余应 采 用固 定 剂固 定和 染 色 后， 在显微镜下 观察其形态 结构 ， 确定其 属、 种。 8 病原体标 本材料的 记录 、标签和整理 制好的标本， 都 应有详细 的 记 录和标签 。标 签上 应 注明编号 、 当 地名称、 采 集 时间、 采 集地点、病 原体 在当地的危害 情况

38、、寄主生物的 情况、病 原体的流行情况 等。 8.1 材料 的记录和标 签 8.1.1 材料的 记录 用碳素 墨水 笔 或黑签字笔书写。 如果有 现成 资 料， 应 收集 整理好， 编好号码， 必要时 把所了 解 的 部分 材料 摘 录下 来 。 收集到的鱼类 标本和病 原体材料，要 避免 在 冲洗 、 移动、 固定 时 发生混乱和 错 误。 如果标本 无标 签 或不清楚 ， 则不能 采用。 8.1.2 标签 8.1.2.1 临时 性的标签 在进行 检查 时取 出的各个 器官 或 病原，为 避免 混 乱而临时 标上 的标签 。 临 时性 使 用至标本装入标本 瓶换 上永久性标签 时 为 止。

39、8.1.2.2 永久 性的标签 用于 已经 固 定好 的标本 或经 过 固定、 染色的病 原体 标本。 应清楚 地标明 病原体 的类 别、病 变 的 器官部 位、 固定 保 存的 方法、标本的 名称 和编号 、检 查 日期和地 点， 必要时写 上 收集 者的姓 名 。 鱼类标本的 编号 要同记录本 或 记录 卡上的编号 一 致，以便 查对。 载 玻片涂 片 或封 存的 寄 生虫 标本，则 用大 小式样相同的标签 ， 写 上名称 、寄 主和 寄 生的 部 位、 发 现寄生 虫 地 点、日期，固 定和染色方法以及 制 片 的日期等。 8.1.2.3 记录 明细卡 具体见 表1 。 DB11/T 3

40、762006 9 表 1 记录明 细卡 水体 编号 ： 日期： 鱼 名： 编 号： 鱼 体 重： 病原体 学名 病原体 俗 名 标本 编号 寄 生 部 位 数量 症 状及 标 本 处 理 采集 寄生 虫地 点 固定和 染 色方法 备注 8.2 标 本的包装和整理 8.2.1 细菌等 病原体标本 将收集 到的 器官 组织，放 入盛 有 冰块的瓶内，迅 速 地 送 往实验 室 编号 安置 。 8.2.2 原生动 物标本 把准备 好的平 底 玻管，装 入 适量 的 70%酒精 （酒精的 高 度应 超过固 定标本的盖 片 的高 度） 。 酒精 的 表面 和瓶塞之间的 空 隙 用脱脂棉填塞 。 保存标本

41、用的 平底玻管用 脱脂 棉塞紧 瓶口。 应 注 意勿使脱脂 棉与酒精之 间 留有 空隙 ， 然后将平底玻 管逐 个放入另一个 大 的 盛有保存液 （70% 酒精 ） 的 广口瓶里。 广 口瓶 内 外应 有 总标 签 ，标 明标本的类 群， 固定 液的种类等 。 9 淡水鱼类检疫 基本操作 按GB/T 15805.1 的规定执 行。 10 常见淡 水鱼类疾病的预防 操作 按DB11/T 196 有关 养殖水质调 控 、鱼病预防的规定 执 行 。 DB11/T 3762006 10 附 录 A （规范性 附录） Earle氏溶液 A.1 Earle 氏溶液配方 表 A.1 Earle氏溶 液 配 方 NaCl（g ） KCl （g ） CaCl 2（无 水 ）（ g） MgSO4 7H2O （g ） 葡萄 糖 （ g） 0.4%酚红（ ml） 6.8 0.4 0.2 0.14 1.0 5 DB11/T 3762006 11 附 录 B （规范性 附录） 葡翁氏 液 B.1 葡翁氏 液 配 方 表 B.1 葡翁氏液液 配方 苦味 酸（饱 和 液） (ml) 福尔马林 原液(ml) 冰醋 酸(ml) 75 25 5