1、,细胞培养技术,细胞培养也叫细胞克隆技术。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。,什么是细胞培养？,主要内容,实验设备 试剂及耗材 清洗及灭菌 细胞培养（细胞生长过程，细胞来源，细胞复苏、传代及冻存，细胞计数，活力测定，细胞污染）,一 实验设备,超净工作台，生物安全柜 CO2培养箱 倒置显微镜 离心机 电热恒温水槽 液氮罐 纯水仪 压力蒸汽消毒器 电热干燥箱,超净台 生物安全柜,酒精灯（），离开要熄灭 ！ 酒精灯（）,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37，5CO2 。,倒置显微镜,离心机,电热恒温水槽,液氮：
2、-196 ,液氮罐,配平,纯水仪 压力蒸汽灭菌器 电热干燥箱,由工作人员操作，注意安全！,小结一 实验设备及功能,超净工作台，生物安全柜-操作平台 CO2培养箱-细胞生长的空间 倒置显微镜-观察细胞 离心机-离心收集细胞 电热恒温水槽-加热 液氮罐-冻存细胞 纯水仪-制备一级水 压力蒸汽消毒器-灭菌 电热干燥箱 -烘干器皿,（酒精灯安全）,二 试剂及耗材,培养基 缓冲液 消化液 血清 其他,耗材,培养基,供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。成分及作用： 氨基酸：组成蛋白质的基本单位 碳水化合物：能量来源 无机盐：帮助细胞维持渗透压平衡 维生素：维持细胞生长的
3、生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用,培养基分类,DMEM（高糖，葡萄糖4500 mg/L ）：成纤维、上皮细胞（293），一些实体瘤（Panc-1），原代神经元DMEM（低糖，葡萄糖1000 mg/L ）：间充质干细胞，单抗细胞融合RPMI 1640： 血液细胞（HL60）、一些实体瘤细胞（BT474）,酚红：PH指示剂（黄色过酸、紫色过碱）； 酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素），涉及到激素和诱导的实验，建议选用无酚红培养基。,ATCC,https:/www.atcc.org/,美国模式培养物集存库,缓冲液（洗涤细胞）,PBS：磷酸缓冲盐溶液具有pH缓冲作用的等渗盐溶液 （常
4、规实验皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl） D-PBS：杜氏磷酸缓冲液，磷酸盐含量稍低，含有钙镁离子，用于胚胎学方面的研究。Hanks：平衡盐溶液无机盐和葡萄糖浓度接近大部分动植物细胞的水平，可作为动植物细胞短期培养(几个小时)。 D-Hanks：不含钙离子、镁离子、葡萄糖（使用消化液时） 。,消化液,胰蛋白酶溶液使细胞间蛋白质水解、细胞离散。使用浓度0.25%。配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清（对胰酶产生抑制作 用）的平衡盐溶液（如PBS、D-Hanks）。 EDTA溶液 一般用其钠盐，可溶性较好。有些组织需要Ca2+ 、Mg2+来保持其完整性，EDTA可以螯合
5、这些离子，可使细胞之间裂解。其作用比胰蛋白酶缓和。使用浓度为0.02%，以无钙、镁的平衡盐溶液配制 。 胶原酶溶液主要水解结缔组织中胶原蛋白成分（用胰蛋白酶效果较差），使用Hanks溶液配置，常用剂量为最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）。,提供基本营养物质、激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保护作用。保存血清最好的方法？建议血清保存在-20。解冻后存放于4时，请勿超过一个月。 （分装）如何解冻血清才不会使产品质量受损?建议从冷冻箱取出后，置于28冰箱使之缓慢解冻、融解。使用时，必须将解冻的血清充分混匀，并且勿将血清置于
6、37太久。,血清,青霉素-链霉素溶液,青霉素的工作浓度为100 U/ml，链霉素的工作浓度为0.1 mg/ml。 分别阻止细菌细胞壁合成及细菌蛋白质的组成，达到抑制细菌生长的作用，防止污染，对真菌和支原体无效。其他实验所需的试剂： 药物（如ATRA）、检测试剂（如MTT）、细胞因子（如SCF）等,试剂标注规范,试剂名称 NaCl 配制浓度 0.5 mM 配制人 张三 配制日期 2016.10.21,耗材,培养皿、瓶、孔板 离心管、移液管 枪尖 其他,小结二 试剂及耗材的分类及用途,培养基（成分、分类） 缓冲液 （PBS、Hanks等） 消化液（分类及应用） 血清（作用、存储及解冻方法） 试剂标
7、签要规范,耗材（分类、用途）,在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。（包括：浸泡（洁消精）、超声波清洗、冲洗、烘干四个步骤）,三 清洗及灭菌,消毒灭菌方法,物理消毒灭菌法 Co60辐射（射线）：破坏生物大分子（塑料制品） 紫外线（200-300 nm）：30min，阻止细菌、病毒核酸合成。（细胞室：用于空气，操作台表面等） 湿热（高压蒸气灭菌法）：121，20min，破坏微生物孢子、蛋白变性。（用于大量液体、玻璃器皿、部分塑料耗材、手术器械等，由工
8、作人员操作） 干热：160, 2 小时，高热作用下的氧化作用破坏微生物（耐高温的玻璃和金属制品） 过滤：0.22m滤膜过滤除菌（少量试剂）,消毒灭菌方法,化学消毒灭菌法 75%酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理（蛋白凝固）（不能擦拭有机玻璃）1新洁尔灭 主要用于器械的浸泡，皮肤和操作室壁面的擦试消毒（阳离子表面活性剂，能破坏细胞膜，改变其通透性而起杀菌作用）,需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。 清洗的步骤灭菌的方法：-紫外线（超净台、生物安全柜）-高压蒸汽灭菌（准备好放在准备室502）-75%酒精（表面消毒，小心酒精灯明火）,小结三 清洗及灭菌,四 细胞
9、培养,生长类型 细胞来源 细胞复苏 细胞传代,细胞冻存 细胞计数 活力测定 污染种类,细胞的生长类型,粘附型细胞：附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。（绝大多数正常细胞及实体瘤细胞）悬浮型细胞：不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（主要是白血病细胞等）,小鼠单核巨噬细胞,白血病细胞,细胞贴壁过程,每代贴壁细胞的生长过程,游离期（接种后在培养液中呈悬浮状态，细胞质回缩，细胞体圆球形） 贴壁期（细胞平均在10分钟4小时贴壁，底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等） 潜伏期（有生长活动，而无细胞分裂，一般为624小时 对数生长期（细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳。最适合进行实验
10、研究） 停止期（平台期）（细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性）（悬浮细胞没有贴壁过程）,国内可以买到细胞株的地方有哪些？ ATCC（美国模式培养物集存库）国内代理 ECACC（欧洲细胞株、微生物保藏中心）国内代理、sigma 中国科学院细胞研究所 中国医学科学院（协和医科大学）基础医学部 武汉大学冷藏中心等,细胞来源,确定细胞株的培养信息（ATCC）配制培养基（基础培养基+10%胎牛血清+双抗）、胰酶、PBS无菌培养瓶、吸管、离心管的准备,准备工作,细胞复苏（快融）,（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37水浴中，使其融化（1分钟左右）。并注意水面不可超过冷冻管盖
11、沿，否则易发生污染情形。 （2）用培养液稀释后低速离心10分钟。 （3）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 （4）隔天换液，但贴壁细胞若未贴壁则勿需处理。,复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而损伤细胞。,细胞传代,细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。,细胞传代,1 悬浮细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶底时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接
12、吹打形成细胞悬液再传代。2 半贴壁细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。,离心 新鲜培养基悬浮 铺板,细胞传代,3 贴壁细胞传代 采用酶消化法传代。常用的0.25的胰酶。吸掉上清，加入PBS缓冲液洗涤，弃掉洗液，加入适量胰酶消化液，37消化1分钟左右，加入含血清的培养基终止消化，并离心去上清，重新稀释后接种。注意： 开放式操作，小心谨慎、谨防污染！,细胞冻存（慢冻）,1 细胞冻存液（1ml/管） 基础培养基70 胎牛血清20 DMSO 10 （二甲基亚砜，一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点
13、，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶对细胞的损伤。）2 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？ 冷冻管内细胞数目一般为1-8x106 cells/ml,缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。,细胞冻存,3 慢冻程序传统方法：4 10分钟 -20 30 分钟 -80 1618 小时（或过夜）液氮长期保存。 程序降温盒：利用异丙醇实现梯度降温（易挥发，并且易吸收空气中的水分，冷冻过程中可以辅助实现缓慢降温，每十分钟降一度）。,细胞冻存,小结四 细胞培养过程,细胞生长类型及传代方法细胞培养过程注意无菌操作（全程）,细胞信息、 方法
14、冻存液成分、培养基、耗材 程序,细胞计数,血细胞计数器：手工计数细胞,细胞计数,计算公式：细胞数/ml4大格细胞总数/ 4稀释倍数 104,细胞计数,注意事项记上不记下，记左不记右。 吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡。 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,培养细胞活力测定,细胞活力测定是体外实验研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。,培养细胞活力测定,1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代
15、所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力。 克隆形成率（克隆形成数接种细胞数）100% 优点：精确、可靠，适于贴壁细胞,培养细胞活力测定,2 台盼蓝法（0.4%）细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活性。,培养细胞活力测定,3 四唑盐（MTT）比色法 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝。 原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细
16、胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。,细胞培养的污染类型,细菌污染 真菌污染 支原体污染 病毒污染 非同种细胞污染 化学污染,细菌污染,小鼠胃癌细胞的球菌感染,念珠菌污染,真菌污染,丝状菌污染,真菌污染,典型的霉菌污染，肉眼看到白色的团块或白点，镜下呈丝状。400倍图片,支原体污染,支原体污染电镜照片(X30k)，煎蛋状和其他形状,细菌和真菌污染多发生在传代、换液、加样等开放性操作之后。原代操作尤其注意！因此，细胞培养切记：“无菌”理念贯穿始终，包括：器皿、器械、
17、耗材、培养基、试剂、操作习惯。（一旦污染、立即弃用！）,如何避免污染？,细节决定成败！,小结五 实验方法,细胞计数的方法 细胞活力测定的方法分类、原理及应用 注意防止细胞污染,总结,细胞实验所需设备的类型及功能 试剂及耗材的分类及各自用途 清洗物品的过程及灭菌的方法 细胞培养 细胞生长过程，细胞来源 细胞培养过程（复苏、传代及冻存） 细胞计数及活力测定方法 注意无菌操作，防止细胞污染,实验中心细胞培养室规章制度,细胞实验室是进行各种细胞培养的净化实验室，研究人员经申请准入、培训合格后方可进入细胞室；所有人员必须遵守实验室规章制度，接受工作人员的管理。 进入细胞室前必须穿工作服、换鞋，非实验物品
18、不得带入室内。严禁带入易燃、易爆及其他有毒、有害或有刺激气味的物品。注意消防安全，杜绝一切可能导致火灾的行为。 不得在细胞室内进行病原性微生物等易传染物的操作；进行病毒感染细胞的操作须报管理人员备案，在指定的生物安全柜内（8室）进行，使用一次性耗材，并遵守生物安全操作规范。 实验室公用物品在使用后必须放回原处，不得外借或带到其它实验室；不得擅自更改仪器程序；仪器发生异常时，应立即向管理人员报告。若因不按操作规程使用造成仪器损坏，使用者应酌情赔偿。 配制试剂应数量适当，标注规范，按规定妥善存放。无菌试剂专人专用，防止交叉污染。未经允许，不得使用他人物品及翻看他人细胞。 若发现细胞被污染，应立即弃用，禁止继续培养和冻存。进入细胞实验室的所有新细胞株，由管理人员建立细胞株库。其他细胞的冻存，由实验者标记明确后存入指定位置。 实验结束后，应及时清理桌面和地面，整理实验器材。观察培养箱，待温度及CO2浓度正常后方可离开。废弃物品应及时带出操作间，进行相应处理。 遵守生物垃圾、利器和生活垃圾分类存放规定，禁止向水槽内倒入杂物、腐蚀性液体和有毒试剂等。,THANKS!,
