1、Juli 2017DEUTSCHE NORM Preisgruppe 17DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 13.060.50!%eAp“2663077www.din.deDIN 38407-47Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abw
2、asser- und Schlammuntersuchung Gemeinsam erfassbare Stoffgruppen (Gruppe F) Teil 47: Bestimmung ausgewhlter Arzneimittelwirkstoffe und weiterer organischer Stoffe in Wasser und Abwasser Verfahren mittels Hochleistungs-Flssigkeitschromatographie und massenspektrometrischer Detektion (HPLC-MS/MS oder
3、-HRMS) nach Direktinjektion (F 47)German standard methods for the examination of water, waste water and sludge Jointly determinable substances (group F) Part 47: Determination of selected active pharmaceutical ingredients and other organic substances in water and waste water Method using high perfor
4、mance liquid chromatography and mass spectrometric detection (HPLC-MS/MS or -HRMS) after direct injection (F 47)Mthodes normalises allemandes pour lanalyse des eaux, des eaux rsiduaires et des boues Substances dterminables ensemble (groupe F) Partie 47: Dtermination des ingrdients pharmaceutiques ac
5、tifs slectionns et dautres substances organiques dans leau et des dchets Mthode par chromatographie en phase liquide haute performance et dtection par spectromtrie de masse (CLHP-MS/MS ou -HRSM) aprs linjection directe (F 47)Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.de
6、Gesamtumfang 42 SeitenDDIN-Normenausschuss Wasserwesen (NAW)DIN 38407-47:2017-07 2 Inhalt Seite Vorwort 4 Einleitung 6 1 Anwendungsbereich . 7 2 Normative Verweisungen . 10 3 Begriffe 10 4 Grundlage des Verfahrens 10 5 Strungen . 11 5.1 Strungen bei der Probenvorbereitung 11 5.2 Strungen bei der Hoc
7、hleistungs-Flssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie 11 6 Bezeichnung 11 7 Reagenzien . 11 8 Gerte . 14 9 Probenahme 14 10 Durchfhrung 15 10.1 Allgemeines . 15 10.2 Probenvorbereitung . 15 10.3 Hochleistungs-Flssigkeitschromatographie (HPLC) 15 10.4 Detektion 16 10.4.1 Allgemeines . 16 10.4
8、.2 Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) . 16 10.4.3 Hochauflsende Massenspektrometrie (HRMS) 16 10.5 Blindwertmessungen . 17 11 Kalibrierung 17 11.1 Allgemeines . 17 11.2 Kalibrierung mit externem Standard . 19 11.3 Kalibrierung mit internem Standard . 19 11.4 Prfung der Kalibrierung . 20 12 Bestimmun
9、g von Wiederfindungsraten 21 12.1 Allgemeines . 21 12.2 Wiederfindungsraten aus Proben . 21 12.3 Wiederfindungsraten von internen Standards 22 13 Auswertung 22 13.1 Besttigung einzelner Substanzen 22 13.2 Berechnung des Einzelergebnisses bei Kalibrierung mit externem Standard . 23 13.3 Berechnung de
10、s Einzelergebnisses bei Kalibrierung mit internem Standard 23 14 Angabe der Ergebnisse 24 15 Analysenbericht . 24 16 Verfahrenskenndaten 24 DIN 38407-47:2017-07 3 Seite (informativ) Verfahrenskenndaten 25 Anhang A(informativ) Beispiele fr Wiederfindungsraten 31 Anhang B(informativ) Beispiele fr HPLC
11、-Sulen und Chromatogramme . 33 Anhang CC.1 Chromatographische Bedingungen fr das Chromatogramm in Bild C.1 . 33 C.2 Chromatographische Bedingungen fr die Chromatogramme in Bild C.2 . 34 C.3 Chromatographische Bedingungen fr das Chromatogramm in Bild C.3 . 35 C.4 Chromatographische Bedingungen fr das
12、 Chromatogramm in Bild C.4 . 36 (informativ) Beispiele fr Detektion . 38 Anhang D(informativ) Beispiele fr Erweiterung des Verfahrens . 41 Anhang ELiteraturhinweise. 42 DIN 38407-47:2017-07 4 Vorwort Dieses Dokument wurde vom Arbeitskreis NA 119-01-03-02-16 AK LC-MS/MS-Verfahren“ des Arbeitsausschus
13、ses NA 119-01-03 AA Wasseruntersuchung“ im DIN-Normenausschuss Wasserwesen (NAW) erarbeitet. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. DIN ist nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Es
14、 ist erforderlich, bei den Untersuchungen nach dieser Norm Fachleute oder Facheinrichtungen einzuschalten und bestehende Sicherheitsvorschriften zu beachten. Bei Anwendung der Norm ist im Einzelfall je nach Aufgabenstellung zu prfen, ob und inwieweit die Festlegung von zustzlichen Randbedingungen er
15、forderlich ist. Die vorliegende Norm enthlt das vom DIN-Normenausschuss Wasserwesen (NAW) und von der Wasserchemischen Gesellschaft eine Fachgruppe in der Gesellschaft Deutscher Chemiker gemeinsam erarbeitete Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung: Bestimmung ausge
16、whlter Arzneimittelwirkstoffe und weiterer organischer Stoffe in Wasser und Abwasser Verfahren mittels Hochleistungs-Flssigkeitschromatographie und massenspektrometrischer Detektion (HPLC-MS/MS oder -HRMS) nach Direktinjektion (F 47). Die als DIN-Normen verffentlichten Deutschen Einheitsverfahren si
17、nd bei der Beuth Verlag GmbH einzeln oder zusammengefasst erhltlich. Auerdem werden die genormten Deutschen Einheitsverfahren in der Loseblattsammlung Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung“ gemeinsam von der Beuth Verlag GmbH und der Wiley-VCH Verlag GmbH sie sind
18、 unter diesen Bedingungen mindestens ein Jahr haltbar. 7.13.3 Zwischenverdnnung-A (Referenzsubstanzen) Zwischenverdnnung mit einer Massenkonzentration der Substanzen von jeweils z. B. 1 g/ml herstellen. Hierfr z. B. je 0,5 ml der Stammlsungen (7.13.2) der Referenzsubstanzen in einem 50-ml-Messkolben
19、 (8.3) vorlegen und die Lsung mit Acetonitril (7.4) bis zur Marke auffllen. Die Lsung unter 15 C vor Licht und Verdunstung geschtzt aufbewahren; sie ist unter diesen Bedingungen mindestens ein Jahr haltbar. 7.13.4 Zwischenverdnnung-B (Referenzsubstanzen) Zwischenverdnnung mit einer Massenkonzentrati
20、on der Substanzen von jeweils z. B. 50 ng/ml herstellen. Hierfr z. B. 0,5 ml der Zwischenverdnnung-A (7.12.3) in einem 10-ml-Messkolben (8.3) vorlegen und die Lsung mit Wasser (7.2) bis zur Marke auffllen. Die Lsung bei 3 C bis 8 C vor Licht und Verdunstung geschtzt aufbewahren; sie ist unter diesen
21、 Bedingungen mindestens einen Monat haltbar. Die Lsung fr die Aufstockung von Proben mit den Analyten zur Bestimmung der Wiederfindungsraten (12.2) verwenden. DIN 38407-47:2017-07 13 7.13.5 Zwischenverdnnung-C (Referenzsubstanzen) Zwischenverdnnung mit einer Massenkonzentration der Substanzen von je
22、weils z. B. 5 ng/ml herstellen. Hierfr z. B. 0,25 ml der Zwischenverdnnung-A (7.13.3) in einem 50-ml-Messkolben (8.3) vorlegen und die Lsung mit Wasser (7.2) bis zur Marke auffllen. Die Lsung bei 3 C bis 8 C vor Licht und Verdunstung geschtzt aufbewahren; sie ist unter diesen Bedingungen mindestens
23、einen Monat haltbar. 7.13.6 Zwischenverdnnung-D (interne Standards) Zwischenverdnnung mit einer Massenkonzentration der Substanzen von jeweils 1 g/ml herstellen. Hierfr z. B. je 0,5 ml der jeweiligen Stammlsung (7.13.2) der internen Standardsubstanzen in einem 50-ml-Messkolben (8.3) vorlegen und die
24、 Lsung mit Acetonitril (7.4) bis zur Marke auffllen. Die Lsung bei 3 C bis 8 C vor Licht und Verdunstung geschtzt aufbewahren; sie ist unter diesen Bedingungen mindestens einen Monat haltbar. 7.13.7 Zwischenverdnnung-E (interne Standards) Zwischenverdnnung mit einer Massenkonzentration der Substanze
25、n von jeweils z. B. 50 ng/ml herstellen. Hierfr z. B. 0,5 ml der Zwischenverdnnung-D (7.13.6) in einem 10-ml-Messkolben (8.3) vorlegen und die Lsung mit Wasser (7.2) bis zur Marke auffllen. Die Lsung bei 3 C bis 8 C vor Licht und Verdunstung geschtzt aufbewahren; sie ist unter diesen Bedingungen min
26、destens einen Monat haltbar. Die Lsung fr die Herstellung von Kalibrierproben und Dotierung von Proben verwenden. 7.13.8 Kalibrierproben Die Kalibrierproben durch entsprechende Verdnnungen der Zwischenverdnnung-C (7.13.5) herstellen. Bei Kalibrierung mit internem Standard (11.3) jeder Kalibrierprobe
27、 die gleiche Menge an internen Standards zusetzen. Kalibierproben ansetzen, z. B. Lsung in der die Massenkonzentration der zu bestimmenden Stoffe jeweils 0,025g/l und die der internen Standardsubstanzen jeweils 0,250 g/l entspricht. Hierfr z. B. 50 l der Zwischenverdnnung-C (7.13.5) in einem 10-ml-M
28、esskolben vorlegen, 50 l der Zwischenverdnnung-E (7.13.7) zufgen und die Lsung bis zur Marke auffllen, z. B. mit Wasser (7.2). Die Zusammensetzung der Kalibrierproben sollte, wenn mglich, den zu untersuchenden Proben hnlich sein und darf zu keiner strenden Peakverbreiterung fhren. Beim Ansatz der Ka
29、librierproben in Trink-, Grund- oder Oberflchenwasser sicherstellen, dass die zu bestimmenden Substanzen nicht enthalten sind. Die Kalibrierproben sind fr jede Messsequenz neu anzusetzen, soweit deren Stabilitt nicht nachgewiesen wurde. 7.13.9 Kontrollstandard Von den Stammlsungen unabhngig hergeste
30、llte Lsung der Referenzsubstanzen, z. B. Lsung einer anderen Bezugsquelle. Die Lsung sollte alle zu bestimmenden Substanzen enthalten. DIN 38407-47:2017-07 14 8 Gerte 8.1 Allgemeines Gerte oder Gerteteile, die mit der Wasserprobe in Berhrung kommen, mssen blindwertfrei sein. Vorzugsweise werden Gert
31、e aus Glas, nicht rostendem Stahl und PTFE (Polytetrafluorethen) verwendet. 8.2 Enghals-Standflaschen, vorzugsweise aus braunem Glas mit NS-Glasstopfen, z. B. Laborflasche, Volumen 250 ml, nach ISO 4796-2 NS 250. 8.3 Messkolben, Nennvolumen 10 ml, 25 ml und 50 ml, z. B. Messkolben ISO 1042 A50 C. 8.
32、4 Mikroliterspritzen 8.5 Spritzenvorsatzfilter, mit geringem Totvolumen, z. B. Durchmesser 13 mm mit Membran aus regenerierter Cellulose. 8.6 Probenvials, passend zum Probenaufgabesystem, z. B. Rollrandflasche, Nennvolumen 1,5 ml mit Brdelkappe und Septum aus Gummi/PTFE. ANMERKUNG Bei Verwendung von
33、 Probenvials aus PE (Polyethylen) knnen Verluste bei den Makroliden minimiert werden. 8.7 HPLC-Sule, vorzugsweise mit Vorsule, geeignet fr die Chromatographie der ausgewhlten Stoffe, Beispiele siehe Anhang C. 8.8 Hochleistungs-Flssigkeitschromatograph, gekoppelt mit Massenspektrometer, bestehend im
34、Einzelnen aus: 8.8.1 Entgasungseinrichtung, z. B. Vakuum-Entgaser. 8.8.2 Analytischem Pumpensystem, pulsationsarm, geeignet fr die binre Gradientenelution. 8.8.3 Manuellem oder automatischem Probenaufgabesystem. 8.8.4 Vorrichtung zur Thermostatisierung der Trennsule, z. B. Sulenthermostat. 8.8.5 Mas
35、senspektrometrischer Detektor (MS/MS, HRMS), vorzugsweise mit Electro-Spray-Ionisation (ESI). 9 Probenahme Proben unter Bercksichtigung der Festlegungen nach DIN 38402-12, DIN 38402-13, DIN 38402-15 und DIN ISO 5667-5 nehmen. Zur Probenahme Standflaschen (8.2) verwenden und die Flaschen vollstndig m
36、it dem zu untersuchenden Wasser fllen. Bei der Entnahme von Trinkwasser, das Oxidationsmittel enthalten kann, gegebenenfalls etwa 50 mg Natriumthiosulfat-Pentahydrat (7.9) je Liter zufgen. Wasserprobe so bald wie mglich nach der Probenahme analysieren. Bei Lagerung die Probe bei 3 C bis 8 C vor Lich
37、t geschtzt aufbewahren, jedoch nicht lnger als drei Wochen. DIN 38407-47:2017-07 15 10 Durchfhrung 10.1 Allgemeines Die Durchfhrung des Verfahrens ist abhngig von der Art der Kalibrierung und den Manahmen, die zur Erkennung und gegebenenfalls zur Korrektur von Matrixeinflssen vorgesehen werden. 10.2
38、 Probenvorbereitung Probe gegebenenfalls ber ein Spritzenvorsatzfilter (8.5) filtrieren. Probe gegebenenfalls an chromatographische Bedingungen anpassen. Bei Kalibrierung mit externem Standard (11.2) gegebenenfalls ein Aliquot der Probe fr die Bestimmung der Wiederfindungsraten entnehmen (12.2). Bei
39、 interner Standardisierung (11.3) der Probe interne Standards zusetzen die zugesetzte Menge so whlen, dass die Massenkonzentrationen der internen Standards in der Probe gleich sind mit denen in den Kalibrierproben (7.13.8). Die durch Zugabe von Reagenzien verursachte Verdnnung der Probe bei der Bere
40、chnung der Einzelergebnisse (13.2) bercksichtigen, soweit sie mehr als 1 % betrgt. Der Anteil an organischen Lsemitteln in den vorbereiteten Proben darf zu keiner zustzlichen Peakverbreiterung fhren. ANMERKUNG Durch Filtration der Probe knnen Verluste bei den Analyten, besonders bei hydrophoben Stof
41、fen (z. B. Makrolide) durch Sorption auftreten. Zum Schutz der Trennsule vor Partikeln kann alternativ zur Filtration ein Inline-Filter verwendet werden. 10.3 Hochleistungs-Flssigkeitschromatographie (HPLC) HPLC-Gert nach den Anleitungen des Gerteherstellers in Betrieb nehmen. Zur chromatographische
42、n Trennung eine geeignete HPLC-Sule (8.7) verwenden und die Trennung der Analyten durch Gradientenelution optimieren. Die chromatographischen Bedingungen so whlen, dass eine optimale Empfindlichkeit bei der massenspektrometrischen Detektion erzielt wird (Beispiele siehe Anhang C). ANMERKUNG 1 Hinsic
43、htlich der Empfindlichkeit ist bei den meisten Substanzen die Verwendung von Gradienten mit Acetonitril/Wasser/Essigsure vorteilhaft. ANMERKUNG 2 Bei gleicher linearer Fliegeschwindigkeit des Eluenten ergeben Sulen mit geringem Innendurchmesser bessere Empfindlichkeiten, als solche mit weiterem Quer
44、schnitt. Eine vollstndige Trennung der Substanzen ist nicht notwendig, sofern sichergestellt ist, dass bei Peakberlappung keine Strungen der quantitativen Bestimmung auftreten. Die krzeste Retentionszeit sollte mindestens dem dreifachen Wert der Totzeit entsprechen. Substanzen, die spektrometrisch n
45、icht vollstndig voneinander aufgelst werden knnen, chromatographisch trennen. In diesen Fllen sollte die chromatographische Auflsung R mindestens R = 1,2 betragen. Das Injektionsvolumen so bemessen, dass sich keine strende Peakverbreiterung oder Strungen der quantitativen Bestimmung ergeben. ANMERKU
46、NG 3 Bei grerem Injektionsvolumen, z. B. 1 ml, bevorzugt Sulenschalttechniken mit geeigneten Anreicherungssulen verwenden. Die Retentionszeiten sollten bei sechs aufeinanderfolgenden Chromatogrammen eine Standardabweichung von 0,03 min nicht berschreiten. DIN 38407-47:2017-07 16 10.4 Detektion 10.4.
47、1 Allgemeines Massenspektrometer nach den Anleitungen des Gerteherstellers in Betrieb nehmen und gertetypische Einstellungen whlen. Fr die Ionisierung der Stoffe wird blicherweise der ESI-Modus bevorzugt. Dabei werden meistens Quasi-Molekl-Ionen von Typ M+H+bzw. MH-gebildet. In Einzelfllen ist unter
48、 bestimmten chromatographischen Bedingungen auch die Bildung von Addukten, z. B. M+NH4+oder M+Na+, mglich. Die meisten Substanzen der Tabelle 1 knnen im positiven ESI-Modus detektiert werden. Die im negativen ESI-Modus nachzuweisenden Substanzen knnen in einem Lauf durch Polarittswechsel oder in einem getrennten Lauf analysiert werden (Tabelle D.1). Bei simultaner Detektion negativer und positiver Ionen, die Schaltzeiten fr den Polarittswechsel so kurz whlen, dass eine ausreichende Anzahl an Datenpunkten erhalten wird. Jeder Peak sollte mit mindestens 12 Datenpunkten registriert wer
