1、Juni 2011 Normenausschuss Wasserwesen (NAW) im DINPreisgruppe 11DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 13.080.10Zur Erstellung einer DIN SPEC knnen verschiedene Ve
2、rfahrensweisen herangezogen werden: Das vorliegende Dokument wurde nach den Verfahrensregeln einer Vornorm erstellt.!$n“1759529www.din.deDDIN ISO/TS 22939Bodenbeschaffenheit Messung von Enzymaktivittsmustern in Bodenproben mit fluorogenenSubstraten in Mikrotiterplatten (ISO/TS 22939:2010)Soil qualit
3、y Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using fluorogenic substrates inmicro-well plates (ISO/TS 22939:2010)Qualit du sol Mesure en microplaques de lactivit enzymatique dans des chantillons de sol en utilisantdes substrats fluorognes (ISO/TS 22939:2010)Alleinverkauf der Spezifikati
4、onen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 17 SeitenDIN SPEC 91203DIN ISO/TS 22939 (DIN SPEC 91203):2011-06 Inhalt Seite Nationales Vorwort. 3 Nationaler Anhang NA (informativ) Literaturhinweise. 3 Einleitung 4 1 Anwendungsbereich . 5 2 Normative Verweisungen 5 3 Abkrzungen
5、. 5 4 Kurzbeschreibung. 5 5 Reagenzien 6 5.1 Pufferlsungen 6 5.2 Substrate und Standards 7 6 Gerte und Materialien 9 7 Durchfhrung. 10 7.1 Probenahme. 10 7.2 Probenvorbereitung 11 7.3 Inkubation 11 7.4 Fluoreszenzmessungen 12 8 Berechnung der Ergebnisse. 12 9 Angabe der Ergebnisse 12 10 Prfbericht .
6、 12 Anhang A (informativ) Anleitung zur Verwendung frisch angesetzter Substratlsungen. 13 A.1 Einleitung . 13 A.2 Reagenzien 13 A.3 Durchfhrung. 14 Anhang B (informativ) Beispiel fr eine graphische Darstellung fr die Berechnung . 15 Literaturhinweise 17 2 DIN ISO/TS 22939 (DIN SPEC 91203):2011-06 Na
7、tionales Vorwort Eine DIN SPEC nach dem Vornorm-Verfahren ist das Ergebnis einer Normungsarbeit, das wegen bestimmter Vorbehalte zum Inhalt oder wegen des gegenber einer Norm abweichenden Aufstellungsverfahrens vom DIN noch nicht als Norm herausgegeben wird. Erfahrungen mit dieser DIN SPEC sind erbe
8、ten vorzugsweise als Datei per E-Mail an nawdin.de in Form einer Tabelle. Die Vorlage dieser Tabelle kann im Internet unter http:/www.din.de/stellungnahme abgerufen werden; oder in Papierform an den Normenausschuss Wasserwesen (NAW) im DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., 10772 Berlin (Hausansch
9、rift: Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin). Diese Technische Spezifikation wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 190 Soil quality“ aufgestellt. Das zustndige deutsche Gremium ist der NA 119-01-02-04 UA Biologische Verfahren“. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Pate
10、ntrechte berhren knnen. Das DIN sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Fr die in diesem Dokument zitierten internationalen Dokumente wird im Folgenden auf die entsprechenden deutschen Dokumente hingewiesen: ISO 10381-6 siehe DIN ISO 10381-6 IS
11、O 10390 siehe DIN ISO 10390 ISO 10694 siehe DIN ISO 10694 Nationaler Anhang NA (informativ) Literaturhinweise DIN ISO 10381-6, Bodenbeschaffenheit Probenahme Teil 6: Anleitung zur Entnahme, Behandlung und Lagerung von Boden unter aeroben Bedingungen fr die Beurteilung mikrobiologischer Prozesse sowi
12、e der Biomasse und der Diversitt unter Laboratoriumsbedingungen DIN ISO 10390, Bodenbeschaffenheit Bestimmung des pH-Wertes DIN ISO 10694, Bodenbeschaffenheit Bestimmung von Phosphor Bestimmung von organischem Kohlenstoff und Gesamtkohlenstoff nach trockener Verbrennung 3 DIN ISO/TS 22939 (DIN SPEC
13、91203):2011-06 Bodenbeschaffenheit Messung von Enzymaktivittsmustern in Bodenproben mit fluorogenen Substraten in Mikrotiterplatten Einleitung Mikroorganismen sind fr viele Schlsselprozesse im Kreislauf der Elemente verantwortlich. Dabei sind Enzyme fr den Abbau organischer Molekle und deren Mineral
14、isation essentiell. Es wird vorausgesetzt, dass die Enzyme im Boden hauptschlich mikrobieller Herkunft sind, auch wenn Ausscheidungen von Pflanzen-wurzeln Enzyme enthalten. Im Boden spielen extrazellulre Enzyme eine wichtige Rolle beim biologischen Abbau organischer Makromolekle. Die gemeinsame Akti
15、vittsbestimmung verschiedener Enzyme, die fr den biologischen Abbau von organischen Verbindungen und die Mineralisation von C, N, P und S im Boden wichtig sind, erlaubt die Untersuchung der Auswirkungen von Chemikalien und anderen anthropogenen Ein-flssen auf die Bodenbiochemie. Allerdings knnen Enz
16、ymaktivittsbestimmungen unter optimierten Labor-bedingungen und unter Verwendung knstlicher Substrate nicht die aktuellen enzymatischen Umsatzraten in Bden in situ wiedergeben. 4 DIN ISO/TS 22939 (DIN SPEC 91203):2011-06 1 Anwendungsbereich Diese Technische Spezifikation legt ein Verfahren zur gemei
17、nsamen Messung verschiedener Enzymaktivitten in Bodenproben fest. Die Enzymaktivitten im Boden variieren je nach Jahreszeit und sind abhngig von chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften des Bodens. Die Anwendung des Verfahrens zum Nachweis der Wirkungen toxischer Chemikalien oder an
18、derer anthropogener Einflsse beruht auf dem Vergleich der Enzymaktivitten mit denen eines vergleichbaren Kontrollbodens oder auf Expositionsuntersuchungen mit Chemikalien oder anderen Behandlungsmethoden. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokumen
19、ts erforderlich. Bei datierten Ver-weisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). ISO 10381-6, Soil quality Sampling Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of
20、 soil under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory ISO 10390, Soil quality Determination of pH ISO 10694, Soil quality Determination of organic carbon and total carbon after dry combustion (elementary analysis) 3 Abkrzungen E.C. En
21、zymklassifikationsnummer nach den Empfehlungen des Nomenklaturkomitees der Internationalen Vereinigung fr Biochemie und Molekularbiologie (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) SOM Gehalt an organischer Bodensubstanz (soil organic matter c
22、ontent) MUB Modifizierter Universalpuffer (modified universal buffer) 4 Kurzbeschreibung In dieser Technischen Spezifikation wird ein Verfahren zur gemeinsamen Aktivittsbestimmung verschiedener Enzyme in Bodenproben beschrieben. Es beruht auf der Verwendung von Bodenproben, die in einer Puffer-lsung
23、 mit fluorogenen Substraten suspendiert und fr 3 h bei (30 2) C in Mikrotiterplatten inkubiert werden. Nach der Inkubation werden die Enzymaktivitten mit einem Mikrotiterplatten-Fluorometer ermittelt 1, 2. Das beschriebene Verfahren basiert auf dem Einfllen und Trocknen von Standard- und Substratlsu
24、ngen in Kavitten von Platten. Dieses Vorgehen ermglicht eine Lagerung der Standards/Sub-strate, begrenzt systematische Fehler infolge von Unterschieden zwischen einzelnen Chargen der Reagenzien und erlaubt einen Vergleich zwischen Reagenschargen. In Anhang A wird ein Verfahren mit eindeutig festgele
25、gter und exakter Inkubationsdauer beschrieben, bei dem frisch angesetzte Reagens-lsungen verwendet werden. Der Vorteil der Anwendung von frisch hergestellten Substratlsungen besteht darin, dass keine Einrichtung zur Gefriertrocknung der Lsungen bentigt wird. 5 DIN ISO/TS 22939 (DIN SPEC 91203):2011-
26、06 5 Reagenzien 5.1 Pufferlsungen 5.1.1 Allgemeines Die Auswahl der Pufferlsung hngt von der Bodenprobe ab, da der pH-Wert die Enzymaktivitten stark beeinflusst. Fr saure Bden mit einem hohen Gehalt an organischer Substanz wurde Natriumacetat-Puffer, 0,5 mol/l, mit einem pH-Wert von 5,5 verwendet. D
27、er Einsatz des modifizierten Universalpuffers (modified universal buffer, MUB) mit dem pH-Wert der Bodenprobe liefert die notwendige Flexibilitt der Methode, um ein breites Spektrum unterschiedlicher Bden untersuchen zu knnen. In den unterschiedlichen Pufferlsungen muss eine angemessene Stabilitt de
28、r Substrate garantiert sein. Eine gute Stabilitt wurde in Natriumacetat-Puffer mit einer Konzentration von 0,5 mol/l und mit einem pH-Wert von 5,5 festgestellt 3. 5.1.2 Natriumacetat-Pufferlsung, 0,5 mol/l, pH-Wert 5,5 Natriumacetat-Trihydrat 68,04 g; mit deionisiertem Wasser auffllen auf 1 000 ml;
29、Essigsure 99,8 %. Natriumacetat-Trihydrat ist in Wasser (z. B. 800 ml) zu lsen und mit konzentrierter Essigsure ( 99,8 %, zur Analyse) auf einen pH-Wert von 5,5 einzustellen. Das Volumen ist mit deionisiertem Wasser auf 1 000 ml aufzufllen. Die Lsung ist in einem Autoklaven fr 20 min bei (121 3) C z
30、u sterilisieren. Die Lsung ist bei Lagerung im Khlschrank hchstens zwei Wochen verwendbar. 5.1.3 Modifizierte Universalpufferlsung (MUB) 4 5.1.3.1 Stammlsung Tris(hydroxymethyl)aminomethan 12,1 g; Maleinsure 11,6 g; Citronensure 14,0 g; Borsure 6,3 g; Natriumhydroxid (1 mol/l) 488 ml; mit deionisier
31、tem Wasser auffllen auf 1 000 ml. Die Substanzen sind zu lsen, und die Lsung ist im Khlschrank aufzubewahren. 5.1.3.2 Gebrauchsfertige Pufferlsung Salzsure (0,1 mol/l); Natriumhydroxid (0,1 mol/l). 200 ml der Stammlsung (5.1.3.1) sind in ein mit einem Magnetrhrstab versehenes 500-ml-Becherglas zu be
32、rfhren, und das Becherglas ist auf ein Magnetrhrwerk zu stellen. Der geforderte pH-Wert ist mit Salzsure oder Natriumhydroxidlsung einzustellen. Das Volumen ist mit deionisiertem Wasser auf 1 000 ml aufzufllen. Die Lsung ist in einem Autoklaven fr 20 min bei (121 3) C zu sterilisieren. 6 DIN ISO/TS
33、22939 (DIN SPEC 91203):2011-06 5.2 Substrate und Standards 5.2.1 Herstellung von Standardlsungen 5.2.1.1 4-Methylumbelliferon-(MUF-)Lsung 4-Methylumbelliferon (MUF) 0,022 0 g; mit Dimethylsulfoxid (DMSO) auffllen auf 25 ml. MUF kann in Pulverform bei Raumtemperatur, jedoch lichtgeschtzt, aufbewahrt
34、werden. MUF ist sorgfltig einzuwgen und in einem braunen Messkolben in DMSO zu lsen, wobei die Einwirkung von Tageslicht zu vermeiden ist. Die Lsung kann nicht gelagert werden. 5.2.1.2 7-Amino-4-methylcumarin-(AMC-)Lsung 7-Amino-4-methylcumarin (AMC) 0,021 9 g; mit Dimethylsulfoxid (DMSO) auffllen a
35、uf 25 ml. AMC kann in Pulverform im Khlschrank aufbewahrt werden. AMC ist sorgfltig einzuwgen und in einem braunen Messkolben in DMSO zu lsen, wobei die Einwirkung von Tageslicht zu vermeiden ist. Die Lsung kann nicht gelagert werden. 5.2.2 Herstellung von Substratlsungen Handelsbliche fluorogene Su
36、bstrate werden in Pulverform geliefert und knnen in tiefgefrorenem Zustand bei (-20 2) C aufbewahrt werden. Am Tag des Gebrauchs sind die Mengen einzuwiegen, die fr Konzentra-tionen von 1 000 mol/l, 2 500 mol/l bzw. 2 750 mol/l in einem Volumen von z. B. 50 ml notwendig sind. Die Einwirkung von Lich
37、t ist zu vermeiden. Das Pulver ist in einem braunen Messkolben einzuwgen und mit DMSO bis zum erforderlichen Volumen aufzufllen. Das Volumen sollte hinreichend gro sein, um eine zuverlssige Einwaage und eine zuverlssige Volumenmessung zu ermglichen. Es hngt auerdem von der Anzahl der bentigten Platt
38、en ab. Die blicherweise verwendeten Probengeber (Dispenser) knnen gleichzeitig nur genau ein Volumen (z. B. 40 l) in acht Reihen verteilen. Um die Anwendung dieser Gerte, die eine gute volumetrische Przision ermglichen, zu erleichtern, sollten von allen Substraten Lsungen mit einer Konzentration von
39、 2 500 mol/l hergestellt werden. Jedoch wird fr die Substrate 4-MUF-D-glucopyranosid und 4-MUF-phosphat eine Lsung der Konzentration 2 750 mol/l bentigt, um die gleiche Endkonzentration von 500 mol/l zu erhalten. Diese beiden Lsungen werden weiter verdnnt, wenn gleichzeitig mit der Zugabe der Probe
40、20 l Dimethylsulfoxid in die Mikrotiterplattenkavitten dieser beiden Substrate gegeben werden, um deren Lsen zu erleichtern. Zur Messung der Chitinase-Aktivitt wird eine geringere Konzentration bentigt, um eine Substrathemmung zu vermeiden, und es kann eine Lsung mit einer Konzentration von 1 000 mo
41、l/l 4-MUF-N-acetyl-D-glucosaminid hergestellt werden, um eine Endkonzentration von 200 mol/l zu erhalten. 5.2.3 Vorbereitung der Mikrotiterplatten Die Substrat- und Standardlsungen werden als Lsungen in die Mikrotiterplatten gegeben und unmittelbar nach dem Verteilen auf den Mikrotiterplatten getroc
42、knet (z. B. gefriergetrocknet). Trockene Platten knnen bei (-20 2) C fr ein Jahr aufbewahrt werden. Whrend der Verarbeitung und der Lagerung der Substrate und Standards muss die Einwirkung von Licht vermieden werden. Getrennte Mikrotiterplatten fr Substrate und Standards haben sich als vorteilhaft e
43、rwiesen. 7 DIN ISO/TS 22939 (DIN SPEC 91203):2011-06 5.2.4 Vorbereitung von Standard-Platten Aufgrund des geringen Probenvolumens ist eine angemessene Anzahl von Wiederholungsmessungen, z. B. drei bis vier Parallelproben, erforderlich. Die Kalibrierung erfordert mehrere Konzentrationen von MUF oder
44、AMC als Mehrfachbestimmung. Whrend der Verdnnung der Standards ist die Einwirkung von Licht zu vermeiden. Das bentigte Volumen, das von der Anzahl der Proben und der vorbereiteten Mikrotiterplatten abhngt, ist zu berechnen. Ein Beispiel fr die Herstellung von Standards, die einen groen Bereich enzym
45、atischer Aktivitt abdecken, ist nachstehend angefhrt, es knnen jedoch in Abhngigkeit vom Bereich der Enzymaktivitten in den untersuchten Proben nderungen vorgenommen werden. Die Stammlsung von MUF mit einer Konzentration von 5 mmol/l wird zur Herstellung der Verdnnungen verwendet, die 1 000 mol/l, 5
46、00 mol/l, 250 mol/l, 125 mol/l, 50 mol/l, 25 mol/l und 5 mol/l MUF enthalten. In die Kavitten der Mikrotiterplatte sind die Volumina (z. B. 40 lN1) einzufllen, die fr eine Mehrfachbestimmung notwendig sind, um Konzentrationen von 0 mol/l, 1,0 mol/l, 5,0 mol/l, 10 mol/l, 25 mol/l, 50 mol/l, 100 mol/l
47、 und 200 mol/l zu erhalten. Dieser Schritt ist hinsichtlich der Messunsicherheit entscheidend. ANMERKUNG 1 Dieser Satz von Stammlsungen erlaubt den Einsatz von automatischen Probengebern, wodurch eine wesentlich bessere Przision erreicht wird als beim manuellen Pipettieren. Die AMC-Stammlsung mit ei
48、ner Konzentration von 5 mmol/l wird zur Herstellung der Verdnnungen verwendet, die 250 mol/l, 125 mol/l, 50 mol/l, 25 mol/l, 5 mol/l, 2,5 mol/l und 0,5 mol/l AMC enthalten. In die Kavitten der Mikrotiterplatte sind die Volumina (z. B. 40 lN1) einzufllen, die fr eine Mehrfachbestimmung notwendig sind, um Konzentrationen von 0 mol/l, 0,1 mol/l, 0,5 mol/l, 1,0 mol/l, 5,0 mol/l, 10 mol/l, 25 mol/l und 50 mol/l zu erhalten. Dieser Schritt ist hinsichtlich der Messunsicherheit entscheidend. ANMERKUNG 2 Dieser Satz von Stammlsungen erlaubt den Einsatz von automatischen Proben
