1、 ICS 65.020.01 DB52 贵州省地方标准 DB 52/T 6042010 马铃薯原原种生产技术规程 2010 - 06 - 24发布 2010 - 07 - 01实施贵州省质量技术监督局 发布DB52/T 604-2010 I 前 言 本标准的附录A是资料性附录。 本标准由贵州省农业委员会提出并归口。 本标准由贵州省种子管理站、贵州省马铃薯研究所、贵州省扶贫技术指导中心、贵州省农技总站负 责起草。 本标准主要起草人：施文娟、黄萍、宋耀、苏跃、杨恩琼、颜谦。 DB52/T 604-2010 1 马铃薯原原种生产技术规程 1 范围 本标准规定了马铃薯脱毒苗和原原种的生产技术。 本标准
2、适用于马铃薯原原种的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 18133 马铃薯脱毒种薯 NY/T 12122006 马铃薯脱毒种薯繁育技术规程 NY/T 4012000 脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 外植体 用于马铃薯茎尖培养的幼芽段。 3.2 培养基 一种人工配制的、适合培养材料生长繁殖的混合养料。主要由一定比例的无机盐、有机物、蔗糖、 植物生长调节剂组成，其中不加凝固剂呈液态
3、的培养基质称为液体培养基，加入凝固剂呈固态的培养基 质称为固体培养基。 3.3 消毒 一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分有害病原菌，而对被消毒物体基本上无 害的措施。 3.4 灭菌 采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施， 如各种高温 灭菌技术措施等。 3.5 扩繁 给予合适的培养条件，在人工配制的培养基上、短期内繁殖出大量新植物体的技术。 3.6 脱毒 DB52/T 604-2010 2 应用茎尖分生组织培养技术，脱去主要危害马铃薯的病毒及类病毒。 3.7 脱毒试管苗 应用茎尖分生组织培养技术获得的再生试管苗，经检测确认不带马铃薯X病毒（
4、PVX）、马铃薯Y病 毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯M病毒（PVM）和马铃薯纺锤块茎 类病毒（PSTVd）的试管苗。 3.8 原原种 用脱毒试管苗或种子在防虫网室、温室条件下生产的符合质量标准的微型薯。 4 脱毒试管苗建立 4.1 薯块选择 选择田间生长势强、健壮、具有该品种典型特征的植株块茎进行脱毒。 4.2 外植体选择 选择无病虫、生长健壮的幼芽，切取带生长点的茎段2.0cm3.0cm，用自来水冲洗干净。 4.3 茎尖剥离 将表面冲洗干净的外植体置于超净工作台上，先用70%的酒精表面消毒10s，用2%的次氯酸钠溶液消 毒10min15min后，无菌
5、水冲洗3次5次，置于无菌滤纸上吸去水分。 将消毒好的外植体置于超净工作台上的双目解剖镜下， 用解剖针轻轻剥去外植体上的未展开小叶至 露出茎尖生长点，在1个2个叶原基（大小0.2cm0.4mm）处用解剖刀小心地将其切下，茎尖向上、切 面向下置于试管或三角瓶内的茎尖诱导培养基上（配方见本标准资料性附录A），封口、编号。 4.4 茎尖组织培养 将马铃薯茎尖置于温度222、光照强度2000Lx3000Lx、每日光照12h16h的光照培养箱或 培养室，培养，茎尖经生长分化即可形成具2片4片展开叶的试管苗。 4.5 试管苗的病毒检测 参照NY/T4012000，采用双抗体夹心酶联免疫法（DotELISA）
6、对各试管苗株系的PVX、PVY、PVS、 PLRV和PVM病毒进行检测，不带以上5种病毒的试管苗即为脱毒试管苗。 5 脱毒试管苗的扩繁 5.1 试管苗的扩繁 在超净工作台上，将形成6片10片叶的马铃薯脱毒试管苗进行切段，每段留1片叶，叶面朝上插在 固体增殖培养基上（配方见本标准资料性附录A），于培养箱或培养室内培养。 5.2 脱毒试管苗扩繁的培养条件 温度222，光照强度2000Lx3000Lx，每日光照12h。 DB52/T 604-2010 3 5.3 脱毒试管苗检测 马铃薯脱毒试管苗扩繁过程中的检测参照GB18133中的5.1.2执行。 6 原原种的生产 6.1 网棚构建 参照NY/T1
7、2122006中的9.3.6执行。 6.2 基质配方 参照NY/T12122006中的9.2执行。 6.3 基质消毒 在组培苗移栽前2Od，用土壤消毒剂（如100倍福尔马林水溶液，按5kg667）对基质进行细菌和 真菌消毒。 6.4 移栽苗的筛选 选择具4片7片叶、株高5cm8cm、根长1.5cm2.0cm的组培苗用于网棚内移栽。 6.5 试管苗的棚内移栽 按照要求选取马铃薯脱毒试管苗，洗去根部培养基后移栽至大棚中，移栽密度是5cm5cm10cm。 6.6 遮荫保湿 移栽前苗床浇透水保持充分湿润，移栽后搭小拱棚并加遮阳网保湿遮阴。中途无需浇水，待苗形成 新根后可拆除小拱棚及遮阳网。 6.7 肥
8、水管理 据基质类型、试管苗的生长状况对其进肥水管理 6.8 病虫害防治 6.8.1 阴天雨季，气温在 1025 时，防治晚疫病的发生，可用 58%甲霜灵锰锌可湿性粉剂 500 倍液、 72%霜霉疫净可湿性粉剂1000倍液或68%银发利700倍液等药剂喷雾防治2次5次， 间隔期7d 15d。 6.8.2 在蚜虫普发季节，用黄板或喷施药剂以防蚜虫，可选药剂如 4.5%高效氯氰菊酯乳油 2000 倍液、 10%吡虫啉 1000 倍液或 40%乐果乳剂 1000 倍液等。 6.8.3 在潜叶蝇普发时间(5 月7 月)，可用 20%斑潜净 3000 倍液、1.8%集琦虫螨克乳油 4000 倍液或 1.8
9、%阿维菌素乳油 2000倍液等药剂防治潜叶蝇的发生。 6.9 原原种采收 一般移栽 60d90d 后下部叶片枯黄便可收获，收获前一周割秧。收获时尽量不要弄破种皮和薯 块，种薯浅层堆放 5d10d 后分级考种，装入网袋置于高温冷库（37）内贮藏。 DB52/T 604-2010 4 A A 附 录 A （资料性附录） 培养基配制方法 A1 仪器和设备 A1.1 高压灭菌锅 A1.2 冰箱 A1.3 烘箱 A1.4 双目实体解剖镜 A1.5 天平 A1.6 酸度计或 pH试纸 A1.7 加热器 A1.8 不锈钢锅 A1.9 量筒、移液管A1.10 烧杯、玻璃棒和滴管 A1.11 试管、三角瓶、培养
10、瓶、耐高温封口材料或瓶盖 A1.12 手术剪、手术刀、解剖针、镊子 A1.13 超净工作台 A1.14 塑料大棚或 60 目网棚 A2 试剂 茎尖组织培养所用试剂为分析纯级别，培养基用水为蒸馏水；试管苗扩繁生产所用试剂为分析或化 学纯级别，水为自来水。 A2.1 MS培养基母液成分及含量（mg/L） 大量元素：硝酸钾 KNO 3 1900，硝酸铵 NH 4 NO 3 1650，硫酸镁 MgSO 4 370，磷酸二氢钾 KH 2 PO 4 170，氯化钙 CaCl 2 2H 2 O 440 微量元素：硫酸锰 MnSO44H 2 O 2230，硫酸锌 ZnSO 4 7H 2 O 860，硼酸 H
11、3 BO 3620，碘化钾 KI 83，钼酸钠 Na 2 MoO 4 2 H 2 O 25，硫酸铜 CuSO 4 5H 2 O 2.5，氯化钴 CoCl 2 6H 2 O 2.5 铁盐：乙二胺四乙酸二钠 Na 2 -EDTA 37.3，硫酸亚铁 FeSO 4 7H 2 O 27.8 有机物：甘氨酸 2.0，盐酸硫胺素 VB 10.4，盐酸吡哆醇 VB 60.5，烟酸 0.5，肌醇 100 A2.2 酒精、盐酸 HCl、氢氧化钠 NaOH、6-苄氨基腺嘌呤 6-BA、萘乙酸 NAA、赤霉素 GA 3A2.3 蔗糖、琼脂 A3 培养基类型 A3.1 茎尖培养基：MS+6-BA 0.5mg/L+NA
12、A 0.05mg/L + GA 30.1mg/L +蔗糖 30g/L +琼脂 69g/L A3.2 固体扩繁培养基：MS + 白糖 30g/L + 琼脂69g/L A4 操作步骤 A4.1 MS培养基母液配制 配制 MS培养基母液使用的水质为蒸馏水、重蒸馏水或无离子水 大量元素母液配制：按 100 倍的用量分别称取各大量元素，并单独定溶配制成母液。每升培养基DB52/T 604-2010 5 取各种母液 10ml。 微量元素母液配制：按 100倍的用量分别称取各微量元素，单独溶解，再混合、定溶。每升培养 基取此母液 10ml。 铁盐配制：按 100 倍用量分别称取两种试剂，单独加热煮沸、再混合
13、，混合后的溶液继续加热使 之充分螯合，冷却后定溶备用。每升培养基用铁盐母液 10ml。 有机物配制：以 100 倍用量分别称量分别溶解，再混合、定溶。每升培养基取此母液 10ml。 A4. 2 植物激素配制： 萘乙酸 NAA 配制：按 0.01mg/ml 浓度适量称取萘乙酸 NAA，先用少许 95%酒精溶解，再用蒸馏 水定溶，置于 4冰箱贮藏待用。 赤霉素 GA 3 配制：按 0.1mg/ml浓度适量称取赤霉素 GA 3 ，先用少许 95%酒精溶解，再用蒸馏水定 溶，置于 4冰箱贮藏待用。 6- 苄氨基腺嘌呤 6-BA 配制：按 0.5mg/ml 浓度适量称取 6-苄氨基腺嘌呤 6-BA，用少
14、许 1N HCl 溶 解，再用蒸馏水定溶，置于 4冰箱贮藏待用。 A4.3 MS培养基配制方法 A4.3.1 溶化琼脂 按需量称取琼脂入不锈钢锅内，加入所需配制培养基体积一半的水，加热溶化琼脂备用。 A4.3.2 加母液 将称量好的各种母液、糖加到溶解好的琼脂液中，继续加热并搅拌，待糖溶解，加水至所需配制 培养基体积，搅拌均匀。 A4.3.3 调 pH 值 用酸度计或精密 pH 试纸（测量范围 5.5-9.0）测量所配制培养基的 pH 值，加 0.1N HCl 或 NaOH 溶液调节培养基 pH值在 5.86.0。 A4.3.4 分装 趁热将培养基分装于试管、三角瓶或培养瓶内（不要将培养基粘附到培养瓶口） ，用耐高温高压 材料封口，待灭菌。 A4.3.5 高压灭菌 用饱和蒸汽彻底排出高压灭菌锅内空气后，加热至121 ，湿热灭菌2040min（灭菌物体 积越大，所需灭菌时间延长）后断电，待灭菌锅气压降至常压后，将培养基移到洁净室，备用。 _
