1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 DB33 浙江省 地 方 标 准 DB33/T 2287 2020 罗氏沼虾双顺反子病毒 -1检测规程 Detection protocols for Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus-1 2020 - 11 - 30发布 2020 - 12 - 30实施 浙江省市场监督管理局 发布 DB33/T 2287 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则给出的规 则起草。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准件由浙江省水产标准化技术
2、委员会归口。 本标准起草单位：浙江省淡水水产研究所。 本标准主要起草人：潘晓艺、沈锦玉、蔺凌云、姚嘉赟、尹文林、曹铮、刘忆瀚、夏炎春。 DB33/T 2287 2020 II 引 言 本标准的发布机构提请注意如下事实，声明符合本标准时，可能涉及到 6.10-6.11中引物与罗氏 沼虾双顺反子病毒全基因组序列及其应用 (专利号： 201110296487.9)专利权的使用。 本标准的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立 场。 该专利持有人已向本标准的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本标准的发布机构备案。相关
3、信息可以通过以下联 系方式获得： 专利持有人：浙江省淡水水产研究所 地址：浙江省湖州市吴兴区杭长桥南路 999号 请注意除上述专利外，本标准的某些内容仍可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利 的责任。 DB33/T 2287 2020 1 罗氏沼虾双顺反子病毒 -1 检测规程 1 范围 本标准确立了罗氏沼虾双顺反子病毒 -1的检测程序，规定了术语与定义、缩略语、罗氏沼虾双顺反 子病毒 -1检测 程序的构成、试剂和材料、器材与设备、操作步骤和结果判定。 本标准适用于罗氏沼虾双顺反子病毒 -1的检测及关联疾病的流行病学调查、诊断和监测。 2 规范性引用文件 下 列文件中的内容通过文中的规
4、范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7202.1 斑节对虾杆状病毒病诊断规 程 第 1部分：压片显微镜检查法 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 罗氏沼虾双顺反子 病毒 -1 Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus-1 罗氏沼虾幼体死亡综合征的主要病毒
5、性病原，又称为罗氏沼虾太湖病毒（ Macrobrachium rosenbergii taihu virus， MrTV）， 属于小 RNA病毒目、双顺反子病毒科、急麻病毒属，病毒粒子为无囊膜的直径约 30 nm的二十面体球形颗粒，核酸类型为单股正链 RNA，长度约 10.3 kb。其主要侵染罗氏沼虾幼体甲壳 下上皮组织和神经节，造成肝脏和结缔组织出现强嗜碱性细胞质包涵体。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（ Base pair） DEPC：焦乙酸二乙酯（ Diethyl pyrocarbonate） DNA：脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleic acid） dA
6、TP：脱氧腺苷三磷酸（ Deoxyadenosine triphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（ Deoxycytidine triphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（ Deoxyguanosine triphosphate） dNTP：脱氧核苷三磷酸（ Deoxyribonucleoside triphosphate） DB33/T 2287 2020 2 dTTP：脱氧胸苷三磷酸（ Deoxythymidine triphosphate） EB：溴化乙啶，核酸染色剂（ Ethidium bromide） MrDV-1: 罗氏沼虾双顺反子病毒 -1（ Macrobra
7、chium rosenbergii dicistrovirus-1） MrTV：罗氏沼虾太湖病毒（ Macrobrachium rosenbergii taihu virus） M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（ Moloney murine leukemia virus） RdRp： RNA依赖的 RNA聚合酶（ RNA-dependent RNA polymerase） RNA：核糖核酸（ Ribonucleic acid） RNasin：核糖核酸酶抑制剂（ RNase inhibitor） RT-PCR：逆转录 -聚合酶链式反应（ Reverse transcription polymer
8、ase chain reaction） Taq：水生噬热杆菌（ Thermus aquaticus） 5 罗氏沼虾双顺反子病毒 -1检测程序的构成 罗氏沼虾双顺反子病毒 -1检测程序包括 5 个阶段，其中 RT-PCR操作阶段又分 3 个步骤。程序流程图 见图 1。 图 1 罗氏沼虾双顺反子病毒 -1检测程序流程图 DB33/T 2287 2020 3 6 试剂和材料 6.1 水：符合 GB/T 6682-2008中一级水的要求，核酸抽提和 RT-PCR应使用无 RNA酶的去离子水。 6.2 dNTPs：含 dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP各 10 mmol/L的混合物， 20 保
9、存。 6.3 RNA酶抑制剂： 40 U/L， 20 保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 6.4 M-MLV逆转录酶： 200 U/L， 20 保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 6.5 5 M-MLV逆转录酶缓冲液： 20 保存。 6.6 10 PCR缓冲液： 20 保存。 6.7 Taq DNA聚合酶： 5 U/L， 20 保存， 避免反复冻融或温度剧烈变化。 6.8 DNA分子量标准： DNA Marker DL2000， 20 保存。 6.9 琼脂糖：电泳级。 6.10 RT-PCR外引物： MrTV572F1： 5 -ATGTA-GAGCG-TGGAG-GAGTA-AAA-3， Mr
10、TV572R1： 5 -CACTA-TCTCT-GTCTT-CGAGG-GATT-3， 扩增 RdRp基因的 572 bp片段。 6.11 RT-PCR内引物： MrTV472F2： 5 -TGCTT-CTATT-TCGGC-TCG-3， MrTV472R2： 5 -CAACG-AATTA-GGGAG-AGG-3， 扩增 RdRp基因的 472 bp片段。 6.12 阳性对照为已知受 MrTV感染且 RT-PCR结果显示强阳性的虾组织， 80 保存。 6.13 阴性对照为已知未受 MrTV感染且 RT-PCR结果显示阴性的虾组织， 80 保存。 6.14 空白对照为无 RNA酶的水。 7 器材
11、与设备 7.1 普通冰箱。 7.2 超低温冰箱 ：最低可设定温度 86 。 7.3 组织研磨器。 7.4 生物安全柜或超净工作台。 7.5 低温高速离心机：温度可设置范围 0 40 ，最高可设定转速 15 000 转 /分钟。 7.6 可控温水浴锅或加热模块。 7.7 微量移液器。 7.8 PCR仪。 7.9 电泳仪。 7.10 水平电泳槽。 7.11 紫外透射仪或凝胶成像仪。 7.12 微波炉。 8 操作步骤 8.1 样品的准备 样品采集的要求和数量按 SC/T 7103和 SC/T 7202.1的规定。 DB33/T 2287 2020 4 鲜活幼体、仔虾及体长在 3 cm以下稚虾个体样品
12、约 30 mg 50 mg (去掉稚虾眼 )；成虾取约 30 mg 50 mg鳃丝或游泳足。 所取样品分 别置于 1.5 mL无 RNA酶微量离心管中，立即进行 RNA提取操作或加入 1 mL TRIzol试剂， 充分研磨后，暂时保存于 20 。 8.2 RNA 模板的提取 在样品管中加入 1 mL TRIzol试剂，用研磨器研磨，置室温 5 分钟后，加入 0.2 mL氯仿，震荡 混匀 15 秒，室温放置 5 分钟。于 4 下， 12 000 转 /分钟 离心 10 分钟，取上层水相，移至一支无 RNA酶的离心管中。加 0.5 mL异丙醇，混匀，置室温 10 分钟。于 4 下， 12 000
13、转 /分钟离心 10 分 钟，尽弃上清。加入 20 预冷的 1 mL无 RNA酶 70%乙醇（无 RNA酶 70%乙醇的配制按附录 A中 A.1 进行），振摇 1 分钟，再于 4 下， 12 000 转 /分钟离心 5 分钟，尽弃上清。敞口离心管，于超净工 作台中室温晾干沉淀。加入 30 L 50 L无 RNA酶的水（无 RNA酶的水的配制按附录 A中 A.2进行） 溶解 RNA沉淀，立即用于 RT-PCR或保存于 80 备用。同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。 RNA 操作时外源性 RNA酶消除方法按附录 B进行。个人防护和实验室安全行为 等应按 GB 19489执行。 也可采用等效商业
14、化的 RNA抽提试剂盒。 8.3 RT-PCR 操作 8.3.1 cDNA 合成 对每一份样品，在一支无 RNA酶的 0.2 mL PCR管中，加入 1.5 L 10 M引物 MrTV572R1， 2.5 L无 RNA酶水和 2 L待测样品 RNA模板。混匀后，稍离心，置于 70 ， 10 分钟，然后立即置于冰中。加入 2 L 5 M-MLV逆转录酶缓冲液、 1 L RNasin (40 U/L)、 0.5 L 10 mmol/L dNTPs、 0.5 L M-MLV 逆转录酶 (200 U/L)， 42 保温 1 小时，以合成 cDNA，然后于 80 中 5 分钟后 ，迅速置于冰中。 8.3
15、.2 第一轮 PCR 扩增 对每一份样品，取一支无 RNA酶的 0.2 mL PCR管，加入 2.5 L 10 PCR缓冲液、 0.5 L 10 mmol/L dNTPs、 0.5 L 10 M引物 MrTV572F1、 0.5 L 10 M引物 MrTV572R1、 0.5 L Taq DNA聚合酶 (5 U/L)、 18.5 L无 RNA酶水和 2 L 8.3.1步骤的逆转录产物，最终反应体系为 25 L。在 PCR后区，置于 PCR仪中， 按以下程序进行第一轮 PCR扩增： a) 95 预变性 3 分钟； b) 94 变性 30 秒 62 退火 30 秒 72 延伸 40秒， 35个循环
16、； c) 72 延伸 7 分钟。 8.3.3 第二轮 PCR 扩增 对每一份样品，取一支无 RNA酶的 0.2 mL PCR管，加入 5 L 10 PCR缓冲液、 1 L 10 mmol/L dNTPs、 0.5 L 10 M引物 MrTV472F2、 0.5 L 10 M引物 MrTV472R2、 1 L Taq DNA聚合酶 (5 U/L)、 41.0 L 无 RNA酶水，最后加入 1 L 8.3.2步骤的扩增产物，最终反应体系为 50 L。在 PCR后区，置于 PCR仪中， 按以下程序进行第二轮 PCR扩增： a) 95 预变性 3 分钟； b) 94 变性 30 秒 62 退火 30
17、秒 72 延伸 40秒， 35个循环； c) 72 延伸 7 分钟。 8.4 琼脂糖电泳 DB33/T 2287 2020 5 用 1电泳缓冲液（ 1电泳缓冲液的配制按附录 A中 A.3进行）配制 2%的琼脂糖凝胶（含 0.5 g/mL EB，按附录 A中 A.4稀释 20000 倍配制而得；或其他等效商品化试剂）。将其放入水平电泳槽中，使电泳 缓冲液刚好淹没胶面，将 5 L PCR扩增产物和 1 L 6载样缓冲液（ 6载样缓冲 液配制按附录 A中 A.5 进行）混匀后加入样品孔，在电泳时设立 DNA分子量标准。 5 V/cm电泳约 0.5 小时，当溴酚蓝到达底部 时停止，在紫外透射仪或凝胶成
18、像仪下观察并拍照记录。 9 结果判定 9.1 阳性对照第一轮 PCR后在 572 bp和 /或第二轮 PCR在 472 bp处有特异条带，阴性对照在 572 bp 和 472 bp处均无条带，且空白对照不出现任何条带，实验有效。否则，应在排除故障和清除污染后， 重新取样检测。 9.2 当被检样品第一轮 PCR产物在 572 bp处有条带和 /或第二轮 PCR后在 472 bp处有特异条带，且 PCR产物测序 结果同参考序列（参见附录 C）相符的，可判定为套式 PCR结果阳性。 9.3 当被检样品第一轮 PCR产物未见大小为 572 bp条带且第二轮 PCR产物未见大小为 472 bp的条带，
19、或经测序确定不是 MrDV-1的，可判定为套式 PCR结果阴性。 9.4 电泳结果分析和问题排除方法见表 1。 表 1 套式 RT-PCR产物的电泳结果分析 实验结果 结果判读及原因分析 对应原因的问题排除 罗氏沼虾样品 第一轮 PCR扩增：阳性对照和阳性 样品在 572 bp处会有特定条带；阴性对 照在 572 bp处无任何条带，以无 RNA酶 水为模板设立的空白对照无任何条带 出现。 第二轮 PCR扩增：阳性对照在 472 bp处会有特定条带出现；阳性样品在 472 bp处会有特定条带出现；阴性对照 在 472 bp处无任何条带，以无 RNA酶水 为模板设立的空白对照无任何条带出 现。 1
20、 RT-PCR反应正常，结果有效。 阳性对照有条带，但分子量标准没 有影像。 1 分子量标准失效或加样量太少。 1. 更换分子量标准或增加其加样量。 分子量标准有影像，但阳性对照无 条带。 1 套式 RT-PCR反应失败。 2 阳性对照失效。 3 逆转录产物成份抑制 PCR。 1. 检查逆转录及 PCR反 应，并更换所用 试剂，纠正出错程序。 2. 更换阳性对照，重新实验。 3. 稀释逆转录产物或纯化 cDNA。 阴性对照组或空白对照组在第一 次 PCR扩增后 572 bp处有特定条带；第 二次 PCR扩增后在 472 bp处有条带出 现。 1 微量移液器污染。 2 试剂污染。 3 环境污染。
21、 4 操作污染。 1. 清洗微量移液器，只能用 PCR后区的 微量移液器跑电泳。 2. 更换试剂。 3. 清洁实验室及所用仪器设备。 4. 不得从 PCR后区到 PCR前区的交流， 加强操作隔离。 DB33/T 2287 2020 6 表 1 套式 RT-PCR产物的电泳结 果分析（ 续 ） 实验结果 结果判读及原因分析 对应原因的问题排除 阳性对照和阴性对照组正常，但已 知带毒样品无条带。 1 RNA模板降解或提取 RNA失败。 2 逆转录或 PCR抑制物介入。 1. 检查与 RNA接触的试剂和用品，重新 提取 RNA。 2. 检查逆转录和 PCR试剂，重新合成 cDNA和 PCR。 分子量
22、标准正常，但阳性对照、阴 性对照和样品出现较多杂带或明显的 弥散区。 1 未注意低温操作，使 PCR出现非特 异性扩增。 2 酶活性变化、 dNTPs浓度变化或 10 PCR缓冲液浓度变化。 3 反应温度控 制异常。 1. 做好低温操作， RT-PCR全程在冰上 操作。 2. 确认预混物制备的准确性、试剂质 量， 10 PCR缓冲液需完全溶解后使用。 3. 检查 PCR仪温控。 琼脂糖凝胶片上无任何影像，包括 DNA分子量标准。 1 紫外观察仪有故障。 2 背景发红太亮。 3 凝胶太厚。 4 电极颠倒或电泳时间过长。 5 EB分解失效。 1. 检查紫外观察仪。 2. 减少 EB用量，将琼脂糖凝
23、胶置于清 水中 30 分钟后再观察结果。 3. 重新制作琼脂糖凝胶片。 4. 改正电极方向，重新加样电泳。 5. 重新配制溴化 乙锭 (EB)。 DB33/T 2287 2020 7 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂配制方法 A.1 无 RNA酶的 70%乙醇 无水乙醇 (新开瓶 ) 70 mL 加入无 RNA酶的水 30 mL 在无 RNA酶的玻璃量筒中配制，混匀，按 1.0 mL/支分装于无 RNA酶的 1.5 mL微量离心管中，保存于 20 待用。 A.2 无 RNA酶的水 水 1000 mL DEPC 1 mL 盖上瓶塞，用磁力搅拌器于 37 剧烈搅拌 12 小时，按 50 m
24、L/瓶 200 mL/瓶分装于无 RNA酶的试剂 瓶内，透气高压蒸汽灭菌 15 分钟，冷却后密封保存。 DEPC有毒，应避免吸 入、吞食和沾着皮肤，操作在通风橱中进行。 A.3 1 电泳缓冲液 Tris 4.84 g 冰乙酸 1.142 mL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0) 2 mL 加水定容至 1000 mL 室温储存。 A.4 10 mg/mL EB贮存液 EB 10 mg 水 1 mL 完全溶解后，室温保存于棕色瓶中。 A.5 6 载样缓冲液 蔗糖 40 g 加水溶解，定容至 100 mL 溴酚蓝 0.25 g 溶解后， 4 储存。 DB33/T 2287 2020 8 B
25、 B 附 录 B （规范性附录） 外源性 RNA酶污染消除方法 B.1 一般介绍 在 RNA操作 过程中，应严格防止 RNA酶污染。 外源性的 RNA酶污染是指来自于水、玻璃制品、塑料器皿、电泳槽、操作人员和微生物等。可通过 DEPC、氯仿、干热烘烤等方法来消除。本附录主要介绍外源性 RNA酶的消除方法。 对 DEPC、酚和胍盐等有毒或有腐蚀性物质，采取措施避免吸入、吞食和沾着皮肤；处理 DEPC和氯仿 的操作均应在通风橱内进行。 B.2 溶液配制 直接用于 RNA操作的所 有水或无机盐溶液都应加入 DEPC至终浓度 0.1%，搅拌 12 小时，然后经 121 高压蒸汽灭菌 15 分钟。不能用
26、 DEPC处理的试剂 (如含有 Tris的溶液 )或 者不能经高压蒸汽灭菌的试剂， 应使用经 DEPC处理的水配制，然后经无 RNA酶的 0.22 m微孔滤膜过滤除菌。 B.3 玻璃制品 玻璃器皿洗净后，在 180 烘烤 4 小时 可彻底除去器皿上沾污的 RNA酶。不得用任何在 180 下可 燃烧、变性或融化的材料包裹器皿。金属制品也可按玻璃制品的办法处理。 B.4 聚丙烯塑料制品 聚丙烯塑料制品可在通风橱内用氯仿漂洗，晾干后再经高压蒸汽灭菌，最后烘干。也可在加有 0.1% DEPC的水中浸泡 12 小时，然后经高压蒸汽灭菌，最后烘干。 可购买无 RNA酶的一次性塑料制品，如塑料离心管、 PC
27、R管 、枪头等，直接使用。 B.5 人工操作 处理 RNA的全部操作应戴无 RNA酶的塑料或乳胶的一次性手套，同时避免因交谈或其它活动造成的飞 沫、落尘带入 RNA酶的污染，必要的情况下戴口罩和实验帽，或在 超净工作台 中进行操作。 B.6 防微生物污染 所有接触 RNA的试剂和材料都应保持无菌，一旦有微生物污染应丢弃。 DB33/T 2287 2020 9 附 录 C （资料性附录） 罗氏沼虾双顺反子病毒 -1套式 RT-PCR检测产物序列 （ GeneBank登录号： NC_018570） 4524 ATGTAGAGCGTGGAGGAGTAAAAGTAGATATAGTTATTTGCGAAT
28、TAGGTGCTTCTATTT 4582 CGGCTCGTAAGGGTATAGTGTCTTATTTTCCGCGCGTGAATGAGTTGTCTAGTCTTAGTG 4642 GTTTAATGGCTAACGGTGAGTTAAGAGTATTTACAACAACCAATTTTGGTAAATTCAATT 4702 TTCTAATTCCCAAAGATTCTTCTGCTATCTTTACTAGGGTTGTGGATCATGTAGAGTCTA 4762 GATCACCAGAAGGTTCTTCGTATTATATAAGGCAAGGTTTTGAAGCAAAGGGAAATTCTG 4822 TTCATGGTGATTGTT
29、GTGCTCCCTACATAATGTTTAATCCGTCTTCGCGTGCTAAGATTG 4882 TGGGTCTCCATTGTGCTGGATTTGCTCAGACATCTCGAGTGTTTGCTCAAATGATAACGC 4942 AGGAGGATATTGCTAGTGCTATGCCCACAACTCATGCAGGACGAGTTTCTACAGAATTTC 5002 CAAATACTTACATTTCGGAGTCCCCTCTCCCTAATTCGTTGTATATTGGTTCAGTGAAAA 5062 CTGCCCCCAATCCCTCGAAGACAGAGATAGTG _ MrTV572R1 MrTV472F2 MrTV572F1 MrTV472R2
