1、ICS 67040X 00中华人民 共禾口 国国家标准农业部1025号公告一242008动物源食品中磺胺二甲嘧啶残留检测酶联免疫吸附法Determination of sulfamethazine residue in edible animal tissues by immunoassay20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布刖 吾农业部1 025号公告242008本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国农业大学、农业部兽药安全监督检验测试中,LI,(-IL京)。本标准主要起草人：沈建忠、何方洋、史为民、冯才伟、张素霞。农业部1025号公告一2
2、42008动物源食品中磺胺二甲嘧啶残留检测酶联免疫吸附法1范围本标准规定了检测动物源食品中磺胺二甲嘧啶残留量的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。本标准适用于动物源食品(猪、鸡肌肉和肝脏、水产、禽蛋、蜂蜜和牛奶)中磺胺二甲嘧啶残留量的筛选检验。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 112001标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则GBT 6682分
3、析实验室用水规则和试验方法3制样31样品的制备将组织样品解冻，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆；将鸡蛋样本打碎，用玻璃棒搅匀防止泡沫的产生；取新鲜的蜂蜜样本；牛奶样本离心去掉脂肪层。32样品的保存组织样本在一20冰箱中贮存备用；禽蛋、蜂蜜样本和牛奶样本在4。C冰箱中贮存备用。4方法提要和原理基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定。酶标板的微孔包被有偶联抗原，加入标准品或待测样品，再加入磺胺二甲嘧啶单克隆抗体和酶标记物。包被抗原与加人的标准品或待测样品竞争抗体，酶标记物与抗体结合。通过洗涤除去游离的抗原、抗体及抗原抗体复合物。加入底物液，使结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液，在450
4、 nm处测定吸光度值，吸光度值与试样中磺胺二甲嘧啶浓度的自然对数成反比。5试剂和材料以下所有试剂，均为分析纯试剂；水为符合GBT 6682规定的二级水。5 1乙腈。52乙酸乙酯。53正己烷。5 4磷酸氢二钠(Na2HP0412H20)。55磷酸二氢钠(NaH。P042H：o)。5 6氢氧化钠。57磺胺二甲嘧啶酶联免疫试剂盒：28 6C冰箱中保存。1农业部1 025号公告一2420085 71酶标板：8孔12条，包被有偶联抗原。5 7 2磺胺二甲嘧啶系列标准溶液：0、l、3、9、27、81 pgL。5 7 3酶标记物。5 7 4磺胺二甲嘧啶抗体。5 7 5底物液(A、B液)。5 7 6终止液。5
5、7 7洗涤液(浓缩液)。5 7 8缓冲液(浓缩液)。5 8缓冲液工作液将缓冲液(2倍浓缩液)50mL用水稀释至100mL备用。5 9乙腈一水溶液量取乙腈84 mL至玻璃瓶中，加入水16 mL混合均匀。5 10 2molL氯化钠溶液称取氯化钠1169 g，加水80 mL搅拌至溶解，再加水定容至100 mL。511 0 5molLHCl溶液取浓HCl 417 mL加人到水中，再用水定容至i00 ml一。5 12 0 5molLNaOH溶液称取氢氧化钠2 g，加水80 mL搅拌至溶解，再加水定容至100 mL。5 13 0 02molL PB缓冲液(pH7 2)称取NazHP0412H：O 5169
6、、Nail。PO。2HzO 087 g至容量瓶中，加水溶解并定容至1 L。5 14 O 05molLPB缓冲液称取Na2HP0412H20 129 g、NaH2PO。2H20 22 g至容量瓶中，加水溶解并定容至1 L。6仪器设备6 1酶标仪(配备450nm滤光片)。6 2匀浆器。6 3振荡器。6 4冷冻离心机。65微量移液器：单道20 pL、50弘L、100止、1 000 pL；多道250止。6 6天平：感量001 g。6 7氮气吹干装置。6 8恒温箱7试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料；取制备后的空白样品，作为空白试料；取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为
7、空白添加试料。8样本提取81组织、禽蛋样本2农业部1025号公告一242008称取试料(3001)g，置50 mI离心管中，加入乙腈水溶液9 mI。混合，振荡10 min。于】5。C、3 800 rmin以上离心10 min，移取上清液3 mL至另一洁净离心管中，加入2 toolL氯化钠溶液2 mL和乙酸乙酯7 mL，混合振荡10 rain，15 6C、3 800 rmin以上速度离心5 min，将上层液转移到离心管中50下氮气吹干，加入002molLPB缓冲液1mL，再加入正己烷1mL振荡1min。15、3 800 rrain离心5 min，去除上层液，取20“L下层液用于分析。稀释倍数为1
8、倍。8 2蜂蜜样本称取试料(1001)g，置50mL离心管中，加入05toolLHCl 2mL，37恒温箱静置30min，取出加入05toolLNaOH 2mL，005molL PB缓冲液5mL混匀，加入乙酸乙酯8mL振荡5min，3 800 rmln以上离心10mln，取上层液4mL于50下氮气吹干，加入002toolL PBlmL涡动20 s，加入1 mL正己烷涡动30 s，3 800 rrain以上离心10 rain，取下层水相20 pL用于分析。稀释倍数为2倍。8 3牛奶样本取适量离心去掉脂肪层的牛奶试料与002 toolL PB缓冲液，按1：19体积比进行稀释(即20止牛奶+380
9、pL 002 toolL PB缓冲液)，取20 pL用于分析。稀释倍数为20倍。9测定步骤9 1试剂的准备9 1 1洗涤液工作液将浓缩洗涤液(20倍浓缩)40mL用水稀释至800mL备用。9 12微孔板条将铝箔袋沿着外沿剪开，取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原铝箔袋中，放入自封袋，保存于2。C8。9 2测定从4。C冷藏环境中取出所需试剂，置室温(20。C25。C)平衡30rain以上，注意每种液体试剂使用前均需摇匀。9 2 1将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。9 2 2加入标准品或处理好的试样20 pL到各自的微孔中，然后
10、加入酶标记物50 pL到每个微孔中，再加入磺胺二甲嘧啶抗体80止到每个微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，室温环境中反应1 hl取出酶标板，将孔内液体甩干，加入洗涤液工作液250L到每个板孔中，洗板4次-5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干。9 2 3加入底物液A液50止液和底物液B液50”L到微孔中，轻轻振荡混匀，室温环境中避光显色30rain。924加入终止液50“L到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处，测定每孔吸光度值。9 3空白对照试验完全按8和9的步骤进行操作。10结果判定和表述101定性测定示例：以9“gL标准液的吸光度值为判定标准，样品吸光度值大于或等于该值为未检出
11、，小于该值为可疑，建议用确证法确证。102定量测定3农业部1 025号公告一242008按以下公式(1)计算百分吸光度值：相对吸光度值一导100(1)上J 0式中：B标准溶液或样品的平均吸光度值；B。o浓度的标准溶液平均吸光度值。将计算的相对吸光度值()对应磺胺二甲嘧啶(“gL)的自然对数，作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出，见公式(2)： x一揣(2)式中：试样中磺胺二甲基嘧啶的含量，单位为微克千克或微克升(ttgkg或tgL)；A试样的相对吸光度值()对应的磺胺二甲基嘧啶含量，单位为微克升(“gL)；，试样稀释倍数；m试样的取样量，单位为克或毫升(g或mL)。计算结果表示到小数点后两位。”检测方法灵敏度、准确度、精密度11 1灵敏度本方法在肌肉样品中磺胺二甲嘧啶的检出限为10 tgkg；在肝脏样品中磺胺二甲嘧啶的检出限为15 tgkg；在蜂蜜样品中磺胺二甲嘧啶的检出限为20”gkg；在禽蛋样品中磺胺二甲嘧啶的检出限为20 ttgkg；在鱼、虾样品中磺胺二甲基嘧啶的检出限为15gkg；在牛奶样品中磺胺二甲嘧啶的检出限为200 pgL。本方法在(肌肉、肝脏、虾、鱼、蜂蜜和禽蛋)样品的定量限(LOQ)为10 tgkg；牛奶样品的定量限(LOQ)为50 tgL。11 2准确度本方法的回收率为50110。113精密度本方法的样本变异系数小于20。4
