1、ICS 67050X 04 囝目中华人民共$-n国国家标准GBT 22955-2008河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中苯并咪唑类药物残留量的测定 液相色谱一串联质谱法Determination of benzimidazoles residues in fugueel and baked eelLCMSMS method2008-12-31发布 2009-05-0 1实施丰瞀鹊鬻瓣訾矬赞星发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 鬲GBT 22955-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国广东
2、出入境检验检疫局。本标准主要起草人；林峰、林海丹、吴映璇、张美金、邵琳智、庞国芳。河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中苯并咪唑类药物残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22955-20081范围本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中苯并咪唑类药物和代谢物残留量的液相色谱一串联质谱检测方法。本标准适用于液相色谱一串联质谱法测定河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中奥芬达唑、芬苯达唑及它们的代谢物奥芬达唑砜，阿苯达唑及其代谢物阿苯达唑一2一氨基砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜，甲苯眯唑及其代谢物氨基甲苯咪唑、羟基甲苯眯唑，氟苯眯唑及其代谢物2一氨基氟苯咪唑，噻苯咪唑及其代谢物5一羟基噻苯咪唑，噻苯咪唑酯，氧苯达唑的残留量。本标准的方法检
3、出限：奥芬达唑、芬苯达唑、奥芬达唑砜、阿苯达唑、阿苯达唑一2一氨基砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、甲苯眯唑、氨基甲苯眯唑、羟基甲苯咪唑、氟苯眯唑、2一氨基氟苯眯唑、噻苯咪唑、5一羟基噻苯咪唑、噻苯咪唑酯、氧苯达唑均为0010 mgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第l部分：总则与定义(GBT 63
4、7912004，ISO 57251：1 994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 637922004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理试样在碱性条件下以乙酸乙酯提取、离心、浓缩后，残渣以乙腈-01 molL盐酸溶液溶解，正己烷脱脂，经MCX固相萃取柱净化。样品溶液供液相色谱一串联质谱仪检测，外标峰面积法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一
5、级水。41乙酸乙酯。42正己烷。43甲醇：色谱纯。44乙腈：色谱纯。45无水硫酸钠：经650灼烧4 h，置于干燥器内备用。46 2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)。47盐酸。】GBT 22955-200848氢氧化钾。49 25氨水。410甲酸：优级纯。411乙酸铵。412 1BHT溶液：称取10 g BHT，乙酸乙酯溶解并稀释至100 mL，临用前配制。413 01 mo|h盐酸溶液：量取浓盐酸9 mL，加水稀释至1 000 mL。414 0005 molL甲酸溶液：准确吸取188 pL甲酸，加水稀释至1 000 mL。415 50氢氧化钾溶液：50 g氢氧化钾溶解于100 mL水中，冷却至室
6、温后待用。416 10氨乙腈溶液：量取i0 mL 25氨水，乙腈稀释至100 mL，临用前配制。417 0025 molL乙酸铵溶液：193 g乙酸铵溶解于l 000 mL水中。418标准品：奥芬达唑(oxfendazole，CAS：5371650一o)、芬苯达唑(fenbendazole，CAS：43210679)、奥芬达唑砜(oxfendazole sulfone，CAS：5402920-8)、阿苯达唑(albendazole，CAS：54965218)、阿苯达唑一2一氨基砜(albendazole_2一aminosulfone，CAS：80983-34-2)、阿苯达唑亚砜(albenda
7、zole sulfoxide，CAS：5402912-8)、阿苯达唑砜(albendazole sulfone，CAS：75184713)、甲苯咪唑(mebendazole，CAS：14798000)、氨基甲苯咪唑(mebendazole-amine，CAS：52329609)、羟基甲苯咪唑(5-hydroxymebendazole，CAS：60254957)、氟苯咪唑(fluhendazole，CAS：13678000)、2-氨基氟苯咪唑(2-aminoflubendazole)、噻苯眯唑(thiabendaz01e，CAS：148798)、噻苯咪唑酯(cambendazole，CAS：26
8、097803)、氧苯达唑(oxibendazole，CAS：20559551)标准品：含量均在98以上，5一羟基噻苯咪唑(thiabendazole-5一hydroxy，CAS：17450500)标准溶液浓度为10 mgL。419标准溶液4191标准储备液准确称取按其纯度折算为100质量的奥芬达唑、芬苯达唑、奥芬达唑砜、阿苯达唑、阿苯达唑2一氨基砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、甲苯眯唑、氨基甲苯咪唑、羟基甲苯咪唑、氟苯咪唑、2一氨基氟苯眯唑、噻苯咪唑、噻苯咪唑酯、氧苯达唑标准品各10 mg(精确至01 mg)，分别用甲醇溶解并定容至100 mL，配成标准储备溶液浓度为100#gmL。4192混合
9、标准工作溶液根据需要，用乙腈一水(1+4)将标准储备液(4191)及5一羟基噻苯咪唑标准溶液配成适用浓度的混合标准工作溶液。混合标准工作溶液使用前配制。420 固相萃取柱：阳离子交换固相萃取柱MCX柱或相当者，150 mg6 mL。使用前依次用5 mL甲醇活化、5 mL 01 molL盐酸平衡。421滤膜：02 pm。5仪器51液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源。52组织捣碎机。53匀浆机：转速大于或等于8 000 rmin。54涡旋振荡器。55离心机：转速大于或等于4 000 rrain。56减压旋转蒸发仪。57超声波水浴。2GBT 22955-200858分析天平：感量01 mg，00
10、1 g。6制样方法从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约500 g，用组织捣碎机充分捣碎均匀，装人洁净容器中，密封，并标明标记，于一18以下冷冻存放。制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。7分析步骤71提取称取2 g样品(准确至001 g)，于50 mL离心管中，加入20 mL乙酸乙酯(41)、015 mL 50氢氧化钾溶液(415)、1 mL 1BHT溶液(412)置超声波水浴中振荡5 rain，匀浆机上8 000 rmin均质30 S，加入1 g无水硫酸钠，混匀，4 000 rmin离心5 rain，清液转移至100mL梨形瓶中；另取一离心管，加入20 mL乙酸乙酯、
11、015 mL 50氢氧化钾溶液和1 mL 1BHT溶液洗涤匀浆机刀头；用玻棒捣碎离心管中的沉淀，加入上述洗涤匀浆机刀头的碱性乙酸乙酯溶液，在涡旋振荡器上振荡2 min，置超声波水浴中振荡5 min，4 000 rrain离心5 min，清液合并至100 mL梨形瓶中，38减压旋转蒸发至干。72净化上述残渣马上用15 mL乙腈溶解，涡旋混匀，超声5 min，加入15 mL 01 molL盐酸溶液(413)，涡旋混匀，转移到15 mL离心管，加5 mL正己烷(42)洗涤梨形瓶，合并转移到离心管中，涡旋混匀，4 000 rmin离心5 rain，弃上层正己烷层，加入3 mL正己烷重复操作一次。脱脂后
12、的样液加入3 mL 01 molL盐酸溶液，涡旋混匀，注入已活化处理的MCX固相萃取柱(420)，依次用5 mL 01 molL盐酸溶液、5 mL甲醇(43)淋洗，15 mL 10氨乙腈溶液(416)洗脱，洗脱液38减压旋转蒸发至干，残渣加入05 mL乙腈，置超声波水浴中振荡5 min，加入15 mL 0025 molL乙酸铵溶液(417)，涡旋混匀，吸取100 pL该样液，加入1 900 pL乙腈一水(1+4)混匀后过02 pm滤膜(421)，供液相色谱一串联质谱仪测定。73测定条件731液相色谱参考条件a)色谱柱：YMC C183 pm，150 mm21 ram(内径)或相当者；b)流动相
13、：乙腈：0005 molL甲酸溶液(414)，梯度洗脱；乙腈：1580(7 rain内线性增eJ加)，80保持2 rain，8015(oOl min内线性递减)，15保持11 rain；流速：025 mLmin；柱温：40；进样量：5 pL。质谱参考条件离子化模式：电喷雾电离正离子模式(EsI+)；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；分辨率：单位分辨率；雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最佳灵敏度；16种苯并咪唑类药物的定性离子对、定量离子对和去集簇电压、碰撞气能量、参考保
14、留时间见表l。30曲02幻o山37GBT 22955-2008表1 16种苯并咪唑类药物和代谢物的参考保留时间、参考质谱参数去集簇电压 碰撞气能量 参考保留时间化合物名称 定性离子对(mg) 定量离子对(mz)V V316159 55奥芬达唑 316159 38 79316191 35300159 50芬苯达唑 300268 37 103300268 35332159 60奥芬达唑砜 332359 31 88332300 35266191 50阿苯达唑 266234 32 92266234 30240133 45阿苯达唑2氨基砜 240133 35 24240198 35282191 55阿苯
15、达唑亚砜 282208 31 67282208 40298224 40阿苯达唑砜 298159 55 78298159 30296105 50甲苯咪唑 296264 40 91296264 35238105 37氨基甲苯咪唑 238105 70 67238133 5129860 50羟基甲苯咪唑 298266 56 7 1298266 31202131 50噻苯咪唑 202175 58 3 3202175 40218147 405羟基噻苯咪唑 218191 47 202181 91 30314123 55氟苯眯唑 314123 43 94314283 4025695 582一氨基氟苯眯唑 25
16、695 95 70256123 39303217 45噻苯咪唑酯 303217 40 74303261 30260176 40氧苯达唑 250218 44 76250218 304GBT 22955-2008733液相色谱一串联质谱测定7331定性测定被测组分选择1个母离子，2个子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在+-25之内；当样品谱图中被铡组分监测离子的相对离子丰度与浓度接近的标准溶液谱图中对应的监测离子的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表z规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示l相对离子
17、丰度K K50 20K50 10K20 KlO允许最大偏差 士20 25 土30 507332定量测定在仪器最佳工作条件下，对混合标准工作溶液进样(4192)，以峰面积为纵坐标，混合标准工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。16种苯并咪唑类药物和代谢物标准物质的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。16种苯并眯唑类药物和代谢物的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。74平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。75空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。8结果计算河豚鱼、鳗鱼、烤
18、鳗中16种苯并咪唑类药物和代谢物的残留量按式(1)计算：xc筹揣 式中：x试样中待测药物残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线得到的待测药物溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；v样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表3、表4、表5。SGBT 22955-
19、2008表3添加浓度范围及重复性和再现性方程(基质为河豚鱼肌肉)单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R阿苯达唑一2一氨基砜 10-Ioo ro832 9m一0619 3 R=0849 2m一0424 52一氪基氟苯咪唑 10100 r一0780 3m一0682 7 R=0973 7m一0677 4阿苯达唑 10100 r=0752 5m一0817 8 R一0569 5m一0192 5阿苯达唑砜 10100 r一1089 9m一1171 9 R一1050 9m一0725 6阿苯达唑亚砜 10100 r=0833 O，l一0581 1 R一0965 9m一0554 5噻苯
20、咪唑酯 10100 r=0908 6m一1054 7 R一1110 lm一0857 6芬苯达唑 10100 r一1148 1mI429 7 R一0700 7m一0285 2氟苯眯唑 10100 r=1202 4嫩一1359 2 R一0986 6拼一0755 0氨基甲苯眯唑 10100 r一0688 0m一0603 7 R一0555 8m一0060 8甲苯咪唑 10100 r一1086 6m一1155 R一1073 9m一086l 0奥芬达唑 10100 r一0872 8m 0843 4 R一0765 4m一0 360 5奥芬达唑砜 10100 r一1144 7m 1322 6 R一1136 6
21、m一0968 9氧苯达唑 10i00 r一0910 3m一1 I 42 7 R一0758 6m一0 436 8羟基甲苯咪唑 10-100 r一0 992 8m1134 1 R一1125 5m一0832 9噻苯眯唑 10100 r一1269 1m一1506 9 R一1 047 0m一0807 65一羟基噻苯眯唑 10100 r一1132 Om 1095 1 R一1076 9m一0788 2注：优为两次测定结果的算术平均值。表4 添加浓度范围及重复性和再现性方程(基质为鳗鱼肌肉)单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R阿苯达唑2一氨基砜 10100 r一0809 lm一05
22、41 7 R一0797 5m一0312 62一氨基氟苯咪唑 10100 r一0 960 9m一0806 0 RI105 5m一0854 4阿苯达唑 10100 r一0987 3m 102l 9 R一0893 9m一0749 6阿苯达唑砜 10100 rI163 4m I193 2 R一0951 0m一0536 0阿苯达唑亚砜 10-100 r一0827 9m一0533 3 R一0896 5m一0518 6噻苯眯唑酯 10-100 r一0901 7m一0875 6 R一0 792 5m一0653 1芬苯达唑 10100 r一1000 9m 1123 3 R一0972 5m一0809 3氟苯咪唑
23、10100 r一1043 2m 0939 5 R一1 092 4m一0938 7氨基甲苯咪唑 10100 同0 756 7m一0598 7 R一0516 9m一0040 0甲苯咪唑 10100 r=Li 150 5m 1177 6 Ri041 im一0783 7奥芬达唑 10100 r一0896 3m一0707 9 R=0765 3m一0364 5奥芬达唑砜 10100 r=1180 8m一1234 I R一0994 Om一0685 8氧苯达唑 10100 r一1329 6m一1565 0 R一0916 6，i一0 661 I羟基甲苯眯唑 10100 r一1094 2m一1054 5 R一0
24、854 1m一0394 1噻苯咪唑 10100 r一1371 7m 1533 7 R一1029 9m一0767 65羟基噻苯咪唑 10100 r一1226 2m 1209 4 R一0847 2m一0426 9注：m为两次测定结果的算术平均值。6GBT 22955-2008表5 添加浓度范围及重复性和再现性方程(基质为烤鳗) 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R阿苯达唑2一氨基砜 10100 r一1248 1m一1425 4 Ri012 8rn一0827 82一氨基氟苯眯唑 10100 rO961 6瓶一0968 6 R一0742 3m一0411 5阿苯达唑 10-1
25、00 r一0957 lm一0 904 9 R一0927 1仇一0 552 3阿苯达唑砜 10-100 r一0990 6mi095 5 Ri009如h一0923 5阿苯达唑亚砜 10100 r一0892 1m一0805 8 R一0853 1m一0570 8噻苯眯唑酯 10-100 r一1193 6m一128l 5 R一0800 4仇一0471 9芬苯达唑 10100 r一1248 1m一1425 4 R1012 8rn一0827 8氟苯咪唑 10100 r一0 857 3m一0914 5 R一0897 7m一0 717 8氨基甲苯咪唑 101。0 r一0662 8m一0521 2 R一0797
26、6m一0 590 1甲苯眯唑 10100 r一0819 5m一0 754 3 R一0995 5m一0 782 5奥芬达唑 10100 r一1213 7m一1 393 3 R一1063 6m一0 999 2奥芬达唑砜 10100 r一0937 8m一0 939 9 R一0864 9m一0551 0氧苯达唑 10-100 r一0621 4m一0 538 5 R一0754 7m-u0 553 6羟基甲苯眯唑 10100 r一0768 1m一0682 9 R一0700 5m一0438 7噻苯咪唑 10100 r一0974 5m一1 100 9 R一0770 4m一0 603 75一羟基噻苯咪唑 101
27、00 r一0798 1m一0 805 2 R一0 911 1m一0801 5注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，被测物的添加浓度范围及再现性方程见表3、表4、表5。7GBT 22955-20086翥4翅蛋2附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图16种苯并眯唑类药物和代谢物标准物质的多反应监测(MRM)色谱图见图A1。7 9 103 926 00e4趔堪4 00“3 0e4鲁i 20e4型香10e40 03 0e4旨趔2 0e4捌督1 0e4
28、81 OOe5趔暑5dmin 0 005 10 15 5 10 157 420e4型菩10 15 5 10 155 0e44 0e4嚣3。0e4善2 0e41 0e4train 0 05 10 15 5 10 15A奥芬达唑B芬苯达唑c阿苯达唑D一噻苯眯唑E噻苯咪唑酯F甲苯眯唑；G 氟苯咪唑；H氧苯达唑；1鲁逾1遥罾C5 Oe44Oe4之掣3 0e4翅磐2Oe41 Oe4mm 0 0。4Oe4量3。4趔霉2 Oe410e4“mln 0 01 5e5i 1 0e5甾罾5 10 155 lO 15OI阿苯达唑2一氨基砜J阿苯达唑亚砜；K奥芬达唑砜；L阿苯达唑砜；i 2 0e4香l 0“tmin 0
29、08 OOe4署6 00“售4 OOe42 00e4tmin 0 006 oe4邑靼4 0e4剖窖2Oe4tmin 0 05 000 0train 0 03 35 10 155 10 15M2氨基氟苯咪唑N氨基甲苯眯唑；o 羟基甲苯眯唑；P5一羟基噻苯眯唑。图A1 16种苯并咪唑类药物和代谢物标准物质的多反应监测(MRM)色谱图D一卜j|斛呲斛呲i1争掣氆譬附录B(资料性附录)回收率GBT 22955-2008河豚鱼肌肉、鳗鱼肌肉、烤鳗中16种苯并咪唑类药物和代谢物的添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B1。表B1 16种苯并咪唑类药物和代谢物的添加浓度及其平均回收率的试验数据平均回收率化合物
30、名称 器加浓度(pgkg)河豚鱼肌肉 鳗鱼肌肉 烤鳗lO 1089 991 106o20 985 965 951奥芬达唑50 987 968 947100 999 10I0 104110 87 9 990 97520 78 7 9I 4 89 1芬苯达唑50 821 870 93 2100 856 90。8 90 910 926 965 95720 894 92 8 936阿苯达唑50 909 93 6 947100 929 95，5 100410 1029 925 93720 947 955 962噻苯眯唑50 959 960 966100 986 997 100610 865 819 80
31、720 828 813 797噻苯眯唑酯50 841 851 90，0100 875 894 83410 915 963 93920 876 905 915甲苯咪唑50 866 906 897100 86 9 925 9089GBT 22955-2008表B1(续)平均回收率化合物名称 添加浓度(pgkg)河豚鱼肌肉 鳗鱼肌肉 烤鳗10 1030 1065 101320 945 981 985氟苯达唑50 960 970 975100 962 995 97810 985 1040 102520 903 943 1004氧苯达唑50 906 910 931100 90I 909 99910 76
32、7 736 85420 983 804 7765一羟基噻苯咪唑50 948 968 801100 1160 945 110810 1118 1028 103220 928 973 1036阿苯达唑2氨基砜50 947 948 871100 1029 1065 104110 934 993 98820 902 868 778阿苯达唑亚砜50 913 925 818100 1012 1039 104510 10S4 1123 109820 979 1054 1044奥芬达唑砜50 1010 1051 1043i00 1023 i056 110510 997 1144 108620 977 1033
33、 1026阿苯达唑砜50 997 1001 1015i00 1021 1033 105110表B1(续)GBT 22955-2008平均回收率化合物名称 添加浓度(pgkg)河豚鱼肌肉 鳗鱼肌肉 烤鳗10 803 794 84020 936 874 9322一氨基氟苯达唑50 992 904 859100 973 993 93210 9Z8 90 0 99 020 880 1034 9402一氨基甲苯眯唑50 913 902 935100 888 92 5 92210 1067 886 95620 95Z 870 9685羟基甲苯哒唑50 94 7 1006 996100 96 2 994 1064
