1、ICS 11. 220 B 41 遥望中华人民=lI工./、和国国家标准G/T 27533-20门犬细小病毒病诊断技术Diagnostic techniques for canine parvovirus disease 2011-11-21发布2012-03-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 27533-2011 目。吕本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位z青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准
2、主要起草人:单虎、温建新、熊炜、黄娟、秦晓冰、于鹏程。I GB/T 27533-2011 犬细小病毒病诊断技术1 范围本标准规定了犬细小病毒病的临床检查、血凝与血凝抑制试验、PCR检测的操作方法。本标准适用于犬细小病毒病的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、血凝与血凝抑制试验、PCR检测适用于犬细小病毒病的病原诊断。2 试剂和材料2.1 FK81细胞(猫肾细胞)。2.2 0.9%生理盐水z配制参见附录A中A.1。2.3 1%猪红细胞液:配制参见附录A中A.202.4 犬细小病毒阳性血清。2.5 96孔v形微量反应板。2.6 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液:Taq酶浓度为5U/I
3、lL，一20oC保存。2. 7 1. 5 mL Eppendorf管。2. 8 o. 2 mL PCR薄壁管。2.9 dNTP:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L，一20OC保存。2. 10 引物z浓度为20mol/L，其序列如下:上游引物(CPVF):5GAA TCT GCT ACT CAG CCA CCA AC 3; 下游引物(CPVR):5GTG CAC TAT AAC CAA CCT CAG C 3。2.11 10%十二烧基硫酸铀z配制参见附录A。2. 12 蛋白酶K贮备液:配制参见附录A中A.4。2.13 5XTBE电泳缓冲液:配制参见附录A中A.603 器材
4、和设备3.1 PCR仪。3.2 高速台式冷冻离心机:可控温至4oC、离心速度可达12000g以上。3.3 水平电泳仪。3.4 凝胶成像系统。4 临床检查4. 1 临床特征4. 1. 1 潜伏期1周到2周，病初元任何症状，食欲减退或废绝，体温40oC以上，粉红色蒙古稠血样物。4. 1.2 病犬先出现呕吐，呕吐出白色泡沫或黄色液体，继而腹泻，粪便稀薄而恶臭，剧烈的腹泻呈喷射状，粪便呈红色，混有大量黠液或假膜。后期排番茄汁样稀便，并有特殊的腥臭味。4. 1. 3 患犬迅速消瘦，倦卧不起，目光呆滞，眼窝下陷，腹围紧缩，机体脱水，皮肤干燥、弹性降低。4.2 病理变化4.2.1 心脏肿大呈灰黄色，切面外翻
5、，质地松软，心肌有出血性斑纹。4.2.2 肝脏肿大，包膜紧张，多呈黄褐色，质地松软有局灶性坏死，断面有豆寇状花纹。4.2.3 胃空虚，带膜轻度潮红，附有大量带液;小肠壁增厚，肠管变粗，肠腔狭窄，形成厚层蒙古膜皱裙，易GB/T 27533-2011 于剥落，肠腔内充满紫红色粥样内容物并混有血凝块。4.3 判定若临床症状符合4.1.1或4.1.2且出现4.2.1或4.2.3的病理变化，则可判定疑似犬细小病毒病，其他临床症状和病理变化可作为参考指标;疑似病例可采用血凝与血凝抑制试验或PCR检测进行确诊。5 血凝与血凝抑制试验5. 1 血凝试验(HA)的操作方法5. 1. 1 样品采集活犬的泪液、鼻液
6、、唾液、粪便，病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心15min，收集上清液待检;口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。5.1.2 在96孔v形微量反应板上进行，自左至右各孔加100L生理盐水。5.1.3 于左侧第1孔加50L待检样品于1.5 mL Eppendorf管，混合均匀后，吸50L至第2孔，混合均匀后，吸50L至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃50L，稀释后病毒稀释度为第1孔1 : 2，第2孔1: 4，第3孔1: 8最后12孔为对照。5. 1. 4 由左至右依次向各孔加1%猪红细胞悬液5切OL置微型?混昆合器上振荡
7、，使血球与病毒充分混合，在3盯7.C温箱中作用1臼5min【-、.5. 1. 5 判定结果:以100%凝集(血球呈颗粒!性性伞状凝集沉于孔底)的病毒最大稀释孔为该病毒血凝价，即一个凝集单位，不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。5.2 血凝抑制试验(HI)的操作方法5.2. 1 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配成4个血凝单位病毒溶液也5.2.2 在96孔v形微量板上进行，用固定病毒稀释血清法，自第1孔至第10孔各加50L生理盐水，11和12孔分别为4单位CPV细胞病毒培养液和抗犬细小病毒阳性血清对照。5.2.3 第1孔加犬细小病毒阳性血清50L，海合均匀，吸50L至第1孔，依此倍比稀释至第10孔
8、，吸弃50L，如此稀释后血清浓度为第1孔1: 2，第2孔1: 4，第3孔1: 8 5.2.4 由第1孔至11孔各加50L，4单位待测病毒液，第12孔50L血清，混合均匀，置37.C温箱再作用15min30 min，待4单位病毒己凝集红细胞可观察结果。5.2.5 判定结果:被已知犬细小病毒阳性血清抑制血凝者，该病毒为犬细小病毒。6 PCR检测6. 1 病料的采集及处理采集的样品包括犬的泪液、鼻液、唾液、粪便及病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3OOOg离心15min，收集上清液待检。口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。经细胞病原分离培养的
9、样品，收集细胞沉淀待检。CPV阳性对照样品和阴性对照样品的同样处理。6.2 DNA抽提取上清被465L，加入25L10%十二皖基硫酸铀和10L的20mg/mL蛋白酶K，50.C水浴摇床上放置2h;加入等量的饱和酣溶液500L，振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液;加入等量的酣=三氯甲烧=异戊醇(25: 24 : 1)，振荡混匀20s，12000g离心5min，取上清液;再加入等量的三氯甲烧=异戊醇(24:1)，振荡?昆匀20s , 12 OOOg离心5min，取上清液;最后加入两倍体积的元水乙醇，上下颠倒混匀，12OOOg离心10rnin，弃上清，室温干燥后，加入50L双蒸水溶解
10、沉淀，即得DNA模板，一20.C贮存备用。CPV阳性对照样品和阴性对照样品与待检样品同步进行样品处理，并进行DNA抽提。另外，DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提试剂盒进行。GB/T 27533-2011 6.3 PCR检测在0.2mL PCR薄壁管中，按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5L、dNTP0.5L、Taq酶O. 5L、DNA模板2L、上游引物和下游引物(CPVF、CPVR)各0.5L、三蒸水18.5L，配制PCR检测体系。将PCR管置PCR仪上按如下程序扩增:首先94oC变性2min;再94oC、30s , 55 oC、30s , 72 oC、40s进行35个循环;最后72
11、oC、3mino用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖平板(含0.5g/mL EB)，参见附录A中A.7，将平板放入水平电泳仪，使电泳缓冲液刚好没过胶面，将10LPCR产物和2L加样缓冲液(6X)，参见附录A中A.8，混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。5V/cm电泳约30min，当澳酣蓝到达底部时停止，用凝肢成像系统观察结果。6.4 结果判定6.4.1 经PCR检测，CPV阳性对照样品可扩增出大小为609bp的核酸片段，参见附录B，且阴性对照样品无扩增条带，否则试验结果视为无效。6.4.2 在符合6.4.1的条件下，若待检样品扩增出了大小为609bp的核酸片段，则初步判定犬
12、细小病毒核酸阳性;若待检样品元扩增条带或扩增条带大小不为609bp，则判定犬细小病毒核酸阴性。6.4.3 待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定，若其序列与提供的比对序列的同源性大于等于90%，则可确诊为犬细小病毒核酸阳性，否则判定犬细小病毒核酸阴性。6.4.4 若犬细小病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性，则可判定犬细小病毒感染阳性。3 GB/T 27533-2011 A.1 0.9%生理盐水附录A(资料性附录)试荆及其配制称取9g元水氧化铀溶于1000 mL去离子水中配成0.9%生理盐水，121.3 .C灭菌15min. A.2 1%猪红细胞液1 mL新鲜肝素抗凝猪血加入9mL灭菌生理盐
13、水制备而成。制备好后最好立即使用。暂时不用可放置4.C冰箱保存。A.3 CPV细胞培养波CPV接种FK81细胞，培养3d5 d，当病变达60%80%时收获。冻融三次或超声波处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液分装后低温保存。A.4 10%十二皖基磺酸铀(SDS)在90mL三蒸水中溶解10g十二皖基硫酸铀(电泳级)，加热至60.C助溶，用盐酸调pH值至7.8，加三蒸水定容至100mL。A.5 蛋白酶K贮备液(20mg/mL) 每升三蒸水中加入三是甲基氨基甲皖(Tris)1. 21 mg，乙二胶四乙酸(EDTA)1.86 mg，十二烧基硫酸铀(SDS)5g，用盐酸调pH值至7.8。取该溶液按每毫升
14、加入20mg蛋白酶K，充分溶解后分装。A.6 5XTBE电泳缓冲渣每升三蒸水中加入三是甲基氨基甲烧(Tris)54. 0 g，乙二股四乙酸(EDTA)2.9mg，棚酸27.5g , 用5mol/L的盐酸调pH值至8.0。A.7 EB核酸染色剂在10mL三蒸水中加入100mg澳化乙链(EB)配制成10mg/mL的浓缩液。A.8 加样缓冲液(6X) 每100mL三蒸水中加入澳酣蓝0.25g和蔚糖40g. 4 附录B(资料性附录)犬细小病毒PCR扩增核酸片段参考序到gaatctgcta ctcagccacc aactaaagtt tataataatg atttaactgc atcattgatg gt
15、tgcattag atagtaataa tactatgcca tttactccag cagctatgag atctgagaca ttgggttttt atccatggaa accaaccata ccaactccat ggagatatta ttttcaatgg gatagaacat taataccatc tcatactgga actagtggca caccaacaaa tatataccat ggtacagatc cagatgatgt tcaattttat actattgaaa attctgtgcc agtacactta ctgagaacag gtgatgaatt tgctacagga acatt
16、ttttt ttgattgtaa accatgtaga ctaacacata catggcaaac aaatagagca ttgggcttac caccatttct aaattctttg cctcaagctg aaggaggtac taactttggt ccatttct aaattctttg cctcaagctg aaggaggtac taactttggt tatataggag ttcaacaaga taaaagacgt ggtgtaactc aaatgggaaa tacaaactat atcactgaag ctactattat gagaccagct gaggttggtt atagtgcac
17、GB/T 27533-2011 5 =ON|町的mhNH菌。国华人民共和国家标准犬细小病毒病诊断技术GB/T 27533-2011 中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数11千字2012年1月第一次印刷开本880X12301/16 2012年1月第一版16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价唔书号:155066. 1-44043 GB/T 27533-2011 打印H期:2012年2月16日F002A
