1、Oktober 2011DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 11DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 65.120!$n,
2、w“1750984www.din.deDDIN EN 16007Futtermittel Bestimmung von Ochratoxin A in Tierfutter durch Reinigung an einerImmunoaffinittssule und Hochleistungs-Flssig-Chromatographie mitFluoreszenzdetektion;Deutsche Fassung EN 16007:2011Animal feeding stuffs Determination of Ochratoxin A in animal feed by immu
3、noaffinity column clean-up and HighPerformance Liquid Chromatography with fluorescence detection;German version EN 16007:2011Aliments pour animaux Dosage de lochratoxine A dans les aliments pour animaux par purification sur colonnedimmuno-affinit et chromatographie liquide haute performance avex dte
4、ction parfluorescence;Version allemande EN 16007:2011Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 19 SeitenDIN EN 16007:2011-10 Nationales Vorwort Dieses Dokument (EN 16007:2011) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 327 Futtermittel Probenahme- und Untersuc
5、hungsverfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom NEN (Niederlande) gehalten wird. Die Mitarbeit des DIN beim Europischen Komitee fr Normung (CEN) wird fr den Bereich des CEN/TC 327 ber das nationale Spiegelgremium, den Arbeitsausschuss NA 057-03-03 AA Futtermittel“ des Normenaus-schusses Lebensmit
6、tel und landwirtschaftliche Produkte (NAL), wahrgenommen. Dieses Dokument wurde unter einem Mandat erarbeitet, das die Europische Kommission und die Europische Freihandelszone dem CEN erteilt haben, und untersttzt grundlegende Anforderungen der EU-Richtlinien. 2 EUROPISCHE NORM EUROPEAN STANDARD NOR
7、ME EUROPENNE EN 16007 August 2011 ICS 65.120 Deutsche Fassung Futtermittel Bestimmung von Ochratoxin A in Tierfutter durch Reinigung an einer Immunoaffinittssule und Hochleistungs-Flssig-Chromatographie mit Fluoreszenzdetektion Animal feeding stuffs Determination of Ochratoxin A in animal feed by im
8、munoaffinity column clean-up and High Performance Liquid Chromatography with fluorescence detection Aliments pour animaux Dosage de lochratoxine A dans les aliments pour animaux par purification sur colonne dimmuno-affinit et chromatographie liquide haute performance avec dtection par fluorescence D
9、iese Europische Norm wurde vom CEN am 25. Juni 2011 angenommen. Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschftsordnung zu erfllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denen dieser Europischen Norm ohne jede nderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten S
10、tand befindliche Listen dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum des CEN-CENELEC oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhltlich. Diese Europische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Franzsisch). Eine Fassung in einer ande
11、ren Sprache, die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch bersetzung in seine Landessprache gemacht und dem Management-Zentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dnema
12、rk, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn, dem Vere
13、inigten Knigreich und Zypern. EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: Avenue Marnix 17, B-1000 Brssel 2011 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mit
14、gliedern von CEN vorbehalten.Ref. Nr. EN 16007:2011 DEN 16007:2011 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Normative Verweisungen4 3 Kurzbeschreibung .4 4 Reagenzien und Werkstoffe4 5 Gerte7 6 Probenvorbereitung.8 7 Messungen .9 8 Bestimmung der Konzentrationen.10 9 Przision .10 10 Unt
15、ersuchungsbericht 12 Anhang A (informativ) Beispiel eines Chromatogramms13 Anhang B (informativ) Ergebnisse des Ringversuchs 14 Literaturhinweise 17 DIN EN 16007:2011-10 EN 16007:2011 (D) 3 Vorwort Dieses Dokument (EN 16007:2011) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 327 Futtermittel Probenahme- und
16、Untersuchungsverfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom NEN gehalten wird. Diese Europische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Verffentlichung eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis Februar 2012, und etwaige entgegenstehende nationale Normen mssen bis
17、 Februar 2012 zurckgezogen werden. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. CEN und/oder CENELEC sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Dieses Dokument wurde unter einem Mandat erar
18、beitet, das die Europische Kommission und die Europische Freihandelszone dem CEN erteilt haben, und untersttzt grundlegende Anforderungen der EU-Richtlinien. WARNUNG Die Anwendung dieser Europischen Norm beinhaltet gefhrliche Substanzen, Arbeitsgnge und Gerte. Diese Norm erhebt nicht den Anspruch, d
19、ass alle mit ihrer Anwendung verbundenen Sicherheitsprobleme angesprochen werden. Es liegt in der Verantwortung des Anwenders dieser Norm, geeignete Vorkehrungen fr den Arbeits- und Gesundheitsschutz zu treffen und vor der Anwendung festzulegen, welche einschrnkenden Vorschriften gelten. Entsprechen
20、d der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diese Europische Norm zu bernehmen: Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Nie
21、derlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. DIN EN 16007:2011-10 EN 16007:2011 (D) 4 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein Verfahren fr die Bestimmung von Ochratoxin A (OT
22、A) in Futtermitteln auf Getreidebasis durch Hochleistungs-Flssig-Chromatographie (HPLC) mit Fluoreszenzdetektion nach Reinigung an Immunoaffinittssulen fest. ANMERKUNG Der validierte Konzentrationsbereich liegt zwischen 39 g/kg bis 338 g/kg OTA. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokum
23、ente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). EN ISO 1042, Laborgerte aus Glas Messkolben (ISO 1042:
24、1998) EN ISO 3696, Wasser fr analytische Laborzwecke Spezifikation und Prfverfahren (ISO 3696:1987) 3 Kurzbeschreibung OTA wird aus dem Untersuchungsmaterial mit einem Gemisch aus Methanol 3%iger wssriger Natrium-hydrogencarbonatlsung extrahiert. Der Extrakt wird filtriert, mit PBS verdnnt und ber I
25、mmunoaffinitts-sulen (IAS) gereinigt. Das gereinigte OTA wird aus der IAS zuerst mit Methanol und anschlieend mit Wasser eluiert, mit Wasser auf ein festgelegtes Volumen gebracht und durch HPLC mit Fluoreszenzdetektion quantitativ bestimmt. 4 Reagenzien und Werkstoffe Falls nicht anders angegeben, w
26、erden bei der Analyse nur analysenreine Reagenzien verwendet. Die Lsemittel mssen von HPLC-Qualitt sein oder besser. 4.1 Methanol, CH3OH, technisch rein 4.2 Methanol, CH3OH, HPCL rein 4.3 Wasser, Wasser (Qualitt 1 nach EN ISO 3696 (HPLC rein) und Wasser (Qualitt 3 nach EN ISO 3696) oder gleichwertig
27、 4.4 Kaliumchlorid, KCl 4.5 Natriumchlorid, NaCl 4.6 Dinatriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat, Na2HPO4 12 H2O 4.7 Acetonitril, CH3CN, HPLC rein 4.8 Essigsure, CH3COOH, mindestens 96%ig 4.9 Lsung aus Acetonitril/Essigsure, Acetonitril (4.7) und Essigsure (4.8) in Anteilen von 99/1 (v/v) 4.10 Toluol, C6
28、H5CH3, analysenrein 4.11 Lsung aus Toluol/Essigsure, Toluol (4.10)/Essigsure (4.8) in Anteilen von 99/1 (v/v) DIN EN 16007:2011-10 EN 16007:2011 (D) 5 4.12 Natriumhydrogencarbonat, NaHCO3, mindestens 99%ige Reinheit 4.13 PBS-Konzentrat, phosphatgepufferte Salzlsung (en: phosphate buffered saline, PB
29、S) Folgende Substanzen sind in 1 800 ml Wasser (Qualitt 1 nach EN ISO 3696) aufzulsen: 4 g KCl (4.4); 160 g NaCl (4.5); 72 g Na2HPO4 12 H2O (4.6). 4.14 PBS, gebrauchsfertig 100 ml PBS-Konzentrat (4.13) sind mit Wasser (Qualitt 1 nach EN ISO 3696) auf 1 000 ml zu verdnnen. Der pH-Wert ist mit 1 mol/l
30、 HCl auf 7,4 einzustellen und das Volumen ist mit Wasser (Qualitt 1 nach EN ISO 3696) auf 2 000 ml aufzufllen, oder PBS-Tabletten, phosphatgepufferte Salzlsung in Tablettenform. Eine in 200 ml Wasser (Qualitt 1 nach EN ISO 3696) aufgelste Tablette ergibt 0,01 mol/l Phosphatpuffer, 0,002 7 mol/l Kali
31、umchlorid und 0,137 mol/l Natriumchlorid, pH-Wert 7,4 bei 25 C (z. B. Sigma P4417). 4.15 3%ige wssrige Natriumhydrogencarbonatlsung 30 g Natriumhydrogencarbonat (4.12) sind zu 1 000 ml Wasser (Qualitt 3 nach EN ISO 3696) hinzuzufgen. 4.16 Extraktionslsemittel, Methanol/3%ige wssrige Natriumhydrogenc
32、arbonatlsung in Anteilen von 50/50 (v/v) 500 ml Methanol (4.1) sind zu 500 ml 3%iger wssriger Natriumhydrogencarbonatlsung (4.15) hinzuzufgen. Es ist gut zu durchmischen. 4.17 Wssrige Essigsurelsung 30 ml Essigsure (4.8) sind zu 870 ml Wasser (Qualitt 1 nach EN ISO 3696) hinzuzufgen und anschlieend
33、ist die Lsung zu filtrieren. 4.18 Mobile Phase fr HPLC, Acetonitril/Methanol/wssrige Essigsurelsung in Anteilen von 35/35/30 (v/v/v). 1 050 ml Methanol (4.2) sind mit 1 050 ml Acetonitril (4.7) und mit 900 ml der wssrigen Essigsurelsung (4.17) zu mischen. Es ist gut durchzumischen und zu entgasen. 4
34、.19 OTA, Ochratoxin A OTA in reiner Form als Kristalle, getrockneter Film, Pulver oder als Lsung. 4.20 OTA-Stammlsung Vom OTA (4.19) ist eine Lsung von 20 g/ml in einer Lsung aus Toluol/Essigsure (4.11) herzustellen. Zur Bestimmung der genauen Konzentration dieser Lsung wird die Absorptionskurve die
35、ser Lsung mit einer Wellenlnge zwischen 300 nm und 370 nm in einer 1-cm-Quarzkvette mit einem UV-Spektrophotometer (5.21) gegen die Toluol/Essigsure-Lsung (4.11) aufgezeichnet. Die Wellenlnge fr die hchste Absorption ist zu ermitteln. Die Massenkonzentration von OTA, ota, in Mikrogramm je Milliliter
36、, ist nach Gleichung (1) zu berechnen: bMA=100maxota(1) DIN EN 16007:2011-10 EN 16007:2011 (D) 6 Dabei ist Amaxdie im Maximum der Absorptionskurve ermittelte Absorption (hier bei 333 nm); M die molare Masse von OTA (M = 403,8 g/mol), in Gramm je Mol; der molare Absorptionskoeffizient von OTA im Tolu
37、ol/Essigsure-Lsung (4.11), (hier 544 m2/mol), in Quadratmeter je Mol; b die Schichtdicke (optische Weglnge) der Quarzkvette, in Zentimeter. 4.21 Stickstoff 4.22 Verdnnte OTA-Stammlsung fr die Kalibrierung Durch 100-fache Verdnnung der OTA-Standardstammlsung (4.20) mit der mobilen Phase (4.18) sind 1
38、0 ml verdnnte OTA-Stammlsung fr die Kalibrierung herzustellen. Dafr sind 100 l OTA-Standardstammlsung in einen Messzylinder zu pipettieren, die Lsung ist unter einem leichten Stickstoffstrom (4.21) bei 40 C zu verdampfen und der Rckstand ist mit der mobilen Phase (4.18) aufzunehmen. ANMERKUNG Um das
39、 vollstndige Auflsen des OTA in der mobilen Phase zu erleichtern, ist zuerst der Messzylinder etwa zu 1/3 zu fllen, das OTA auflsen zu lassen, und anschlieend ist bis zur Marke aufzufllen und zu schtteln. 4.23 Kalibrierlsungen Von der verdnnten OTA-Stammlsungen fr die Kalibrierung (4.22) sind sechs
40、Konzentrationen der Kalibrierlsungen durch berfhrung der in Tabelle 1 aufgefhrten Volumina der verdnnten Stammlsung in einen Messkolben mit dem angegebenen Volumen herzustellen und mit der mobilen Phase (4.18) ist bis zur Marke aufzufllen: Tabelle 1 Empfohlene Kalibrierlsungen (4.23) fr die Bestimmu
41、ng von OTA Kalibrierlsung Verdnnte OTA-Stammlsung fr die Kalibrierung (4.22) Messkolben (5.5) OTA-Konzentration l ml ng/ml1 50 10,0 1 2 250 10,0 5 3 500 10,0 10 4 750 10,0 15 5 1 000 10,0 20 6 1 250 10,0 25 4.24 IAS mit fr OTA spezifischen Antikrpern Die IAS enthlt Antikrper, die gegen OTA gerichtet
42、 sind. Die Sule muss eine Gesamtkapazitt von mindestens 100 ng OTA aufweisen. Die OTA-Wiederfindung darf nicht geringer als 85 % sein, wenn 5 ng OTA in 50 ml eines Gemisches von 4 Volumenteilen des Extraktionslsemittels (4.16) und 96 Volumenteilen PBS, gebrauchsfertig, (4.14) angewendet werden. 4.25
43、 Aufstocklsung OTA in einer Lsung von Acetonitril/Essigsure (4.9) in Anteilen von 99/1 (v/v). Die OTA-Konzentration der Aufstocklsung ist abhngig von der geforderten Aufstockungskonzentration. Das Aufstockungsvolumen sollte etwa 500 l betragen. Die Lsung kann von der OTA-Stammlsung (4.20) in hnliche
44、r Weise hergestellt werden wie die verdnnte OTA-Stammlsung fr die Kalibrierung (4.22). DIN EN 16007:2011-10 EN 16007:2011 (D) 7 5 Gerte bliche Laborgerte und insbesondere Folgendes: 5.1 Handelsbliche Laborglasgerte, wie z. B. Messzylinder, Becherglser, Messpipetten 5.2 Analysenwaage, mit einer Fehle
45、rgrenze von 0,1 mg 5.3 Horizontal- oder Vertikalschttelmaschine 5.4 Automatisches SPE-Vakuumsystem 5.5 Messkolben, (Klasse A nach EN ISO 1042), 5 ml, 10 ml, 100 ml 5.6 Vorgefaltetes Filterpapier, Partikelrckhaltevermgen 30 m 5.7 Kolben mit Schraubkappe, 250 ml und 500 ml 5.8 Glastrichter, 9 cm Innen
46、durchmesser (ID) 5.9 Vorratsgefe, Polypropylen, zum Anbringen oben auf der IAS, Gre 50 ml bis 75 ml 5.10 Injektionsspritzen aus Kunststoff, 5 ml 5.11 Kalibrierte Transfermikropipette, 100 l, 500 l und 1 000 l (variables Volumen) 5.12 Vakuumfiltrationssystem fr das Lsemittel, geeignet fr 47-mm-Filter
47、 5.13 Glasmikrofaser-Filter, Partikelrckhaltevermgen 1,6 m 5.14 Vortex-Mischer 5.15 Filterpatrone fr HPLC-Injektionsspritze, Nylon mit 0,45 m Porenweite 5.16 Ultraschallbad 5.17 Flschchen aus Braunglas, etwa 2 ml Fassungsvermgen und mit Crimpverschlssen oder gleichwertig 5.18 HPLC-System Das HPLC-Sy
48、stem besteht aus Folgendem: Pumpe, pulsationsfrei, Durchflusskapazitt 0,5 ml/min bis 1,5 ml/min; Injektionssystem, manuell oder automatischer Probengeber, mit fr Injektionen von 100 l bis 300 l geeigneter Schleife; Fluoreszenzdetektor, geeignet fr Messungen mit Anregungswellenlngen von 333 nm und Emissions-wellenlngen bei 467 nm; Integrator, oder PC-Arbeitsstation. 5.19 Analytische HPLC-Umkehrphasen-Trennsule, eine fr die ausreichende Trennung des OTA von den anderen Strkomponenten geeignete C18 RP-Sule; voll endcapped mit Sulenmaen von vorzugsweise 250 mm 4,6 mm ID, stat
