1、 AFNOR 2002 Tous droitsrservsFA120539 ISSN 0335-3931NF V 08-059Novembre 2002Indice de classement : V 08-059ICS : 07.100.30Microbiologie des alimentsDnombrement des levures et moisissures par comptage des colonies 25 CMthode de routineE : Microbiology of food and animal feeding stuffs Enumeration of
2、yeasts and mouldsby colony-count technique at 25 C Routine methodD : Mikrobiologische Unstersuchung von Lebensmitteln Zhlung der Hefe und Schimmelpilzen durch Koloniezhlung bei 25 C RoutineverfahrenNorme franaise homologue par dcision du Directeur Gnral dAFNOR le 5 octobre 2002 pour prendre effetle
3、5 novembre 2002.Remplace la norme exprimentale XP V 08-059, de novembre 1995.Correspondance la date de publication du prsent document, il nexiste pas de travaux europens ou inter-nationaux traitant du mme sujet.Analyse Le prsent document fait partie dun ensemble de normes dfinissant tant des mthodes
4、 derfrence que des mthodes de routine, applicables pour effectuer les examens et vrifier lescritres microbiologiques des aliments pour lalimentation humaine ou animale, utilisables toutautant par les producteurs pour la mise en application dune politique de qualit, que par lesorganismes de contrle p
5、our la protection du consommateur.Cet ensemble de normes se compose de mthodes horizontales et de mthodes dapplicationspcifiques et complmentaires pour le contrle microbiologique des produits.Ce document spcifie une mthode de routine, simplifie par rapport la mthode de rf-rence (NF ISO 7954) pour le
6、 dnombrement des levures et moisissures par comptage descolonies obtenues en milieu solide aprs incubation en arobiose 25 C.Descripteurs Thsaurus International Technique : alimentation humaine, alimentation animale, produitalimentaire, produit dalimentation animale, analyse microbiologique, dnombrem
7、ent, microor-ganisme, champignon, levure, moisissure, comptage, mthode danalyse.Modifications Par rapport au document remplac, les modifications essentielles portent sur les pointssuivants : prfrence de lensemencement en profondeur par rapport lensemencement en surface ; incubation 3 jours et 5 jour
8、s au lieu de 3, 4, 5 jours ; ne pas retourner les botes pendant lincubation. AFNOR 2002 AFNOR 2002 1er tirage 2002-11-Fdite et diffuse par lAssociation Franaise de Normalisation (AFNOR) 11, avenue Francis de Pressens 93571 Saint-Denis La Plaine Cedex Tl. : + 33 (0)1 41 62 80 00 Fax : + 33 (0)1 49 17
9、 90 00 www.afnor.frCorrectionsMicrobiologie des aliments AFNOR V08BMembres de la commission de normalisationPrsident : MME POUMEYROLSecrtariat : MME GUISSE AFNORM ARROUY CELIA SAMME BADUEL MINISTERE DE LAGRICULTURE ET DE LA PECHE DGALM BARLET SILLIKER SAM BAROUX LABORATOIRE DEPT DANALYSESMME BASILLE
10、 VILLE DU HAVRE LEAMME BERNARD UNION INVIVO ETS UCAABM BEUGNIES LDA 26M BILLAUX SSHA ISHAMME BOHNERT AFSSAMME BONNET LABORATOIRE DEPT VETERINAIREMME BOSSERDET GROUPE ENTREMONTM BOUDET SOLABIAMME CARRABIN SILLIKER SAM CATEL LABO DEPARTEMENTAL DANALYSESM CATHERINE IFREMERM CATTEAU MICHEL CATTEAUM CHER
11、ONT MINISTERE DE LECONOMIE, DES FINANCES ET DE LINDUSTRIE DGCCRF LABO INTERREGIONALM CHEVALIER LASAM CHORIN COFRACM CLAISSE CNRSMME COIGNARD ASEPT SARLMME COLLIGNON VILLE DE PARIS LABO DHYGIENEMME DE BUYSER AFSSAM DEBERGHES NESTLE FRANCEM DEBRAILLY NESTLE GRAND FROIDMME DESFORGES BIOMERIEUX SAMME DE
12、SVIGNES BIO-RADM DO VALE ELVIR SAMME DOLLER LABORATOIRE DES DOUANESM DOREY LABORATOIRE DEPT FRANK DUNCOMBEMME DUBOIS SOLABIAM EMONARD OXOIDM ETIEVANT SERVICE LABO DEPARTEMENTAL NIEVREMME EWE INSTITUT PASTEUR DE LILLEM FACON BIO-RADMLLE FERRANDON LCI-SODIAAL INTERNATIONAL-RICHES MONTSMME FORT-LUCMARE
13、T MINISTERE DE LECONOMIE, DES FINANCES ET DE LINDUSTRIE DGCCRF LABO INTERREGIONALMLLE FOURMOY MINISTERE DE LA DEFENSE SCERCATMME GARREC ADRIAMME GAUDOT MINISTERE DE LAGRICULTURE ET DE LA PECHE DGALMME GUICHAOUA MINISTERE DE LECONOMIE, DES FINANCES ET DE LINDUSTRIE DGCCRF LABO INTERREGIONALM GUITOT N
14、ESTLE FRANCEMME GUYARD ADRIA NORMANDIEMLLE HERBIN LABO NAT VETERINAIRE DE RUNGISMME HORRIERE LABORATOIRES 3M SANTEM HUGUES VILLE DE NICEMME HUMBERT LDA 22MME IOTTI LEHA 3 NF V 08-059MLLE JARDY MINISTERE DE LECONOMIE, DES FINANCES ET DE LINDUSTRIE DGCCRF LABO INTERREGIONALMME LAFARGE AFSSAMLLE LAHELL
15、EC AFSSAMME LE BA CTCPAM LE BORGNE LBO LABO BROMATOLOGIE OUESTMME LE GUERN-FELLOUS BIO-RADM LECLERCQ INSTITUT PASTEUR DE LILLEMME LEONETTI CNIELM LESNE ENSP ECOLE NAT SANTE PUBLIQUEM LOMBARD AFSSAM MAISONNEUVE VWR INTERNATIONALM MARTINET MINISTERE DE LA DEFENSE SCERCATM MARTIRE CRCBMME MARTY-GARREC
16、MINISTERE DE LECONOMIE, DES FINANCES ET DE LINDUSTRIE DGCCRF LABO INTERREGIONALMME MORE FOULD SPRINGER SAM OCHIN IAALMME ONNO ATG LIFE LABORATOIRESMME POLIAK LABO DEPARTEMENTAL SARTHEMME POUMEYROL AFSSAMME RAFFIN SGS CERVAC WOLFFM RAMBACH CHROMAGARM ROBERT SILLIKER SAMME ROBIN LACTALIS R & DM ROGGE
17、FCDMME ROISIN FCDMME ROLLIER CECALAITM ROMESTANT AES LABORATOIREM ROSEC MINISTERE DE LECONOMIE, DES FINANCES ET DE LINDUSTRIE DGCCRF LABO INTERREGIONALMME ROUSSELLE AGRO ANALYSEMME RUDELLE AFSSA LERPACMLLE SESQUES LIALMCMME SORIN DIFFCHAMB SAMME VINCENT-RACE MINISTERE DE LAGRICULTURE ET DE LA PECHE
18、DGALM WAYMEL CLABO CONSEIL FRANCENF V 08-059 4 1 Domaine dapplication 52 Rfrences normatives 53 Termes et dfinitions 54Princpe 65 Diluant et milieu de culture 66 Appareillages et verrerie 77 chantillonnage 78 Prparation de lchantillon pour essai 89 Mode opratoire 810 Expression des rsultats . 811 Fi
19、dlit de la mthode 812 Rapport dessai . 8SommairePage 5 NF V 08-0591 Domaine dapplicationLe prsent document dcrit une mthode de routine, simplifie par rapport la mthode de rfrence(NF ISO 7954) pour le dnombrement des levures et moisissures dans les produits destins la consommationhumaine ou lalimenta
20、tion animale, par comptage des colonies obtenues en milieu solide aprs incubation enarobiose 25 C.NOTE Dans les aliments humidit intermdiaire et les aliments dshydrats, il peut exister des levures et moisissuresosmophiles ou xrophiles strictes qui peuvent ncessiter des milieux de culture particulier
21、s et diffrents de ceux prconissdans le prsent document.2 Rfrences normativesLe prsent document comporte par rfrence date ou non date des dispositions dautres publications. Ces rf-rences normatives sont cites aux endroits appropris dans le texte et les publications sont numres ci-aprs.Pour les rfrenc
22、es dates, les amendements ou rvisions ultrieurs de lune quelconque de ces publications nesappliquent ce document que sils y ont t incorpors par amendement ou rvision. Pour les rfrences nondates, la dernire dition de la publication laquelle il est fait rfrence sapplique.NF EN ISO 6887, Microbiologie
23、des aliments Prparation des chantillons, de la suspension mre et desdilutions dcimales en vue de lexamen microbiologique (indices de classement : V 08-010-1, V 08-010-2,V 08-010-3 et V 08-010-4). 1)NF ISO 7218, Microbiologie des aliments Rgles gnrales pour les examens microbiologiques (indice declas
24、sement : V 08-002).NF ISO 7954, Microbiologie Directives gnrales pour le dnombrement des levures et moisissures Technique par comptage des colonies 25 C (indice de classement : V 08-022).XP V 08-102, Microbiologie des aliments Rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression desrsultats.3
25、Termes et dfinitionsPour les besoins du prsent document, les termes et dfinitions suivants sappliquent.3.1levurechampignons microscopiques unicellulaires qui se dveloppent en formant des colonies rondes ou lenticulaires3.2moisissuresmicroorganismes filamenteux qui, la surface dun milieu glos dvelopp
26、ent des thalles tendus, plats ou duve-teux, prsentant souvent des fructifications colores et des formes de sporulation3.3thallesappareil vgtatif des moisissures, parfois improprement appel aussi colonie. Le dveloppement des thallessur un milieu de culture peut provenir soit de la germination de spor
27、es, soit de la croissance de fragmentsmycliens1) Les parties 2, 3 et 4 sont en prparation.NF V 08-059 6 4Principe4.1 Ensemencement en profondeur du milieu de culture (5.3), avec une quantit dtermine de lchantillonpour essai si le produit examiner est liquide, ou avec une quantit dtermine de suspensi
28、on-mre dans le casdautres produits.Dans les mmes conditions, ensemencement des dilutions dcimales obtenues partir de lchantillon pour essaiou de la suspension-mre, raison dune bote par dilution.NOTE Lensemencement peut galement tre ralis en surface. Cette technique est privilgier dans le cas de dnom
29、-brement de levures uniquement.4.2 Incubation des botes 25 C, en arobiose pendant 3 jours et 5 jours.NOTE Dans le cas de dnombrement de genres de moisissures supposes connues, la temprature dincubation peuttre diffrente de 25 C, choisie aprs accord entre les deux parties (20 C ou 22 C) et indique da
30、ns le rapport dessai.4.3 partir du nombre de colonies obtenues dans les botes de Petri retenues (voir 10.1), calcul du nombre delevures et moisissures par millilitre ou par gramme dchantillon.5 Diluant et milieu de culture5.1 GnralitsPour les pratiques courantes de laboratoire, voir NF ISO 7218.5.2
31、DiluantVoir NF EN ISO 6887 et la norme spcifique du produit analyser.5.3 Glose pour dnombrement5.3.1 Base5.3.1.1 Composition5.3.1.2 PrparationDissoudre les composants dans leau, en portant bullition.Si ncessaire, ajouter le pH de sorte quaprs strilisation, il soit de 6,6 0,2, 25 C.Rpartir le milieu
32、glos dans des rcipients appropris (6.8).Striliser lautoclave (6.1) rgl 121 C pendant 15 min.NOTE Le chloramphnicol peut tre remplac par loxyttracyline. Dans ce cas, prparer le milieu de base comme dcritci-dessus, en omettant le chloramphnicol, le rpartir raison de 100 ml et striliser. Prparer galeme
33、nt une solutionExtrait de levure 5,0 gGlucose 20,0 gChloramphnicol 0,1 gAgar 9 g 18 g a)Eau 1 000 mla) Selon le pouvoir glifiant de lagar-agar.0,1%(m/m) de chlorhydrate doxyttracyline dans de leau et striliser par filtration. Au moment de lemploi, ajouter asep-tiquement 10 ml de cette solution 100 m
34、l de milieu de base fondu et maintenu entre 44 C et 47 C. 7 NF V 08-0595.3.2 Solution de gentamicine5.3.2.1 Composition5.3.2.2 PrparationDissoudre le sulfate de gentamicine dans de leau et striliser la solution par filtration.5.3.3 Milieu completLa gentamicine est ajoute dans le milieu de base prala
35、blement refroidi 47 C uniquement dans le cas o lonsouponne la prsence de contamination importante par des bactries Gram ngatif pouvant tre trouves en par-ticulier dans des viandes et les produits de pche crus.6 Appareillages et verrerieMatriel courant de laboratoire de microbiologie (voir NF ISO 721
36、8), et en particulier, ce qui suit :6.1 Appareil pour la strilisation en chaleur sche (four) ou en chaleur humide (autoclave).6.2 tuve, rglable 25 C 1 C.Dans le cas dutilisation dtuve ventile, il faut placer les botes de Petri dans des botes ou sacs pour viter ladshydrations des milieux et dissminat
37、ion des spores.6.3 Agitateur, type vortex.6.4 Bote de Petri striles, en verre ou en matire plastique.6.5 Pipette gradues coulement total, de capacit nominale de 1 ml ou 2 ml, gradues au 0,1 ml.6.6 Bain deau, ou dispositif similaire rglable entre 44 C et 47 C.6.7 pH-mtre, ayant une prcision de lectur
38、e de 0,01 unit pH permettant de raliser des mesures prcises 0,1 unit pH 25 C.6.8 Tubes essai, flacons ou fioles de capacit approprie.7 chantillonnageIl est important que le laboratoire reoive un chantillon reprsentatif, non endommag ou modifi lors du trans-port et de lentreposage.Lchantillonnage ne
39、fait pas partie de la mthode spcifie dans le prsent document. Effectuer lchantillonnageconformment la norme du produit concern. Sil nexiste pas de norme spcifique, il est recommand que lesparties concernes se mettent daccord ce sujet.Sulfate de gentamicine 50,0 gEau 50 mlMilieu de base (5.3.1) 100 m
40、lSolution de gentamicine (5.3.2) 10 mlLa quantit dchantillon pour laboratoire doit tre suprieure aux besoins de lanalyse. Il est recommand de pou-voir disposer dune quantit dchantillon permettant une rptition danalyse.NF V 08-059 8 8 Prparation de lchantillon pour essaiUtiliser tel quel lchantillon
41、pour laboratoire.Les produits stables sont stocks temprature ambiante. Les produits pouvant saltrer seront conservs2C 2 C de faon ce que leur microflore ne soit pas affecte.9 Mode opratoire9.1 Prise dessai, suspension-mre et dilutionsPrparer la suspension-mre et les dilutions conformment la NF EN IS
42、O 6887.9.2 Ensemencement et incubation9.2.1 Prendre une bote de Petri strile (6.5). Transfrer laide dune pipette strile, 1 ml de lasuspension-mre.9.2.2 Prendre une autre bote de Petri strile. Transfrer laide dune nouvelle pipette strile 1 ml de lapremire dilution dcimale de lchantillon.Recommencer l
43、es oprations dcrites au 9.2.1 avec les dilutions suivantes. Avant chaque prlvement pourlensemencement, homogniser le contenu du tube laide de lagitateur de type vortex (6.3).9.2.3 Couler dans les botes environ 10 ml du milieu refroidi entre 44 C et 47 C laide dun bain deau (6.6).Par un mouvement de
44、rotation, mlanger soigneusement linoculum et le milieu et laisser se solidifier en posantles botes de Petri sur une surface frache et horizontale.NOTE Dans le cas dun ensemencement en surface, utiliser le milieu (5.3.3) pralablement coul en botes de Petri etsch. Ensemencer 0,1 ml de la dcimale appro
45、prie par bote de milieu.9.2.4 Incuber les botes pendant 3 jours et 5 jours 25 C 1C.Ne pas retourner les botes pour lincubation et entre les lectures pour viter de rensemencer les gloses avecles spores de moisissures dissmines par cette manipulation.9.3 Numration des moisissures et levuresAprs la pri
46、ode dincubation procder au comptage des levures et des thalles prsents.Ne retenir que les botes contenant moins de 150 thalles ou levures au niveau de deux dilutions successives.NOTE Ne retentir que les botes pour lesquelles les thalles ne confluent pas.10 Expression des rsultatsVoir annexe B de la
47、norme XP V 08-102.11 Fidlit de la mthodeVoir NF ISO 7218.12 Rapport dessaiLe rapport dessai doit indiquer la mthode utilise et les rsultats obtenus. Il doit, en outre, mentionner tous lesdtails opratoires non prvus dans le prsent document, ou facultatifs, ainsi que les incidents ventuels suscep-tibles davoir agi sur le rsultat dessai.Le rapport dessai doit donner tous les renseignements ncessaires lidentification complte de lchantillon.
