1、1.2.2 目的基因的导入、检测与鉴定,专题1 1.2 基因工程的基本操作程序,学习目标 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。 2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。,方式一 通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。 在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。,方式二 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。在完成将目的基因导入受体细胞这一步骤后，在全部的受体细胞中，
2、真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。,新知导学,达标检测,内容索引,新知导学,1.转化的含义 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内 的过程。,一、将目的基因导入受体细胞,维持稳定和表达,2.转化的方法 (1)导入植物细胞 农杆菌转
3、化法：将目的基因导入 和裸子植物时最常用方法。,双子叶植物,a.土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的 化合物，吸引农杆菌侵染，其 质粒上的 (可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的 上。,酚类,Ti,T-DNA,染色体的DNA,b.方法步骤： 插入Ti质粒的 上转入 导入植物细胞目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上目的基因表达。 基因枪法：将目的基因导入 植物常用的方法。 目的基因包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面用基因枪高速射入或组织中目的基因表达。 花粉管通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加目的基因，使目的基因借助 进入
4、受体细胞。,目的基因,T-DNA,农杆菌,单子叶,受体细胞,花粉管通道,(2)导入动物细胞 方法： 技术。 常用受体细胞： 。 步骤：目的基因表达载体 取卵(受精卵) 受精卵发育获得具有新性状的转基因动物,显微注射,受精卵,提纯,显微注射,(3)导入微生物细胞 原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、 等。 常用的方法： a.用 处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。 b.感受态细胞和重组表达DNA分子在 中混合，细胞吸收重组表达载体DNA分子。,遗传物质相对较少,Ca2,缓冲液,1.上述方法中，在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体
5、的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。 2.对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 3.对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。,4.大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。,例1 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：,(1)一
6、般情况下农杆菌不能感染的植物是_，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现_的目的。 具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T-DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞_上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到_(部位)即可。,单子叶植物,将目的基因导入植物细胞,染色体的DNA,T-DNA片段(内部),解析 一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。利用其感染性，可实现目的基因导入植物细胞的目的。真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌T-DNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。,答案,解析,(2)根据T-DNA这一转移
7、特点，推测该DNA片段上可能含有控制_酶合成的基因。,DNA连接酶、限制,解析 根据T-DNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。,答案,解析,(3)图中c过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是_类化合物。,酚,解析 植物细胞受伤后可产生酚类物质，促进农杆菌向植物细胞转移。,答案,解析,(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还可采取_ _ (至少写出两种)。,基因枪法、花粉管,通道法,解析 植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。,答案,解析,农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析 第一次拼
8、接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。,易错易混,例2 下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是 A.基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济和有效 B.显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法 C.大肠杆菌最常用的转化方法，是使细胞的生理状态发生改变 D.农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法,解析 不同受体细胞导入目的基因的方法不同，每种方法都有利弊。目的基因导入植物
9、细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济和有效；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术；目的基因导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，完成转化。,答案,解析,1.分子水平的检测 (1)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中： 技术。,二、目的基因的检测与鉴定,用 标记的含有目的基因的 片段制成基因探针。将转基因生物的_ _提取出来，和基因探针进行杂交，如果出现 ，说明目的基因已插入受体细胞的DNA中。,DNA分子杂交,放射性同位素,单链DNA,基因组,DNA,杂交带,(2)检测目的基因是否转录： 技术。 将转基因生物提取出来的 和基因探针进行
10、杂交，如果出现 ，说明目的基因已经转录。 (3)检测目的基因是否翻译： 技术。 从转基因生物提取出来的 和 进行杂交，如果出现_ _，说明目的基因已经翻译。,分子杂交,mRNA,杂交带,抗原抗体杂交,蛋白质,相应的抗体,杂,交带,2.个体水平的鉴定 (1) 的接种实验。 (2)有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行 。,抗虫或抗病,活性比较,1.目的基因的检测与鉴定归纳,归纳总结,2.不同分子检测原理的异同 (1)在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。检测原理都是碱基互补配对原则，只是被检测的物质不同，
11、一个是转基因生物的基因组DNA，一个是转基因生物细胞内的mRNA。 (2)进行翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。,例3 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是 检测受体细胞的染色体上是否有目的基因 检测受体细胞是否有致病基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译出了蛋白质 A. B. C. D.,答案,例4 利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是 A.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B.大肠杆菌中检测到人胰岛素
12、基因及其mRNA C.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列 D.酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白,答案,解析,解析 基因表达的产物是蛋白质，因此，只有在受体细胞中检测或提取到了相应蛋白质才能证明目的基因在受体细胞中完成了表达，A、C项只能说明完成了目的基因的导入，B项只能说明完成了目的基因的导入和目的基因的转录过程。,关注基因工程操作过程的四个易误点 (1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒一般只需要限制酶剪切1次，产生2个黏性末端或平末端，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。 (2)切割目的基因和载体
13、并非只能用同一种限制酶：如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下，目的基因与载体也可以连接起来。,名师点拨,(3)目的基因的插入点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。 (4)基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象。,学习小结,基因工程 的基本操 作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入_,导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞,目的基因的 _,分子水平检测,技术 分子杂交技术杂交,水平的鉴定,受体细胞,DNA分子杂交,抗原抗体,个体,检测与鉴定,达标检
14、测,1.将目的基因导入玉米茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，应分别采用的方法是 A.显微注射技术 农杆菌转化法 B.基因枪法 花粉管通道法 C.农杆菌转化法 显微注射技术 D.基因枪法 显微注射技术,1,2,3,4,5,答案,解析 玉米是单子叶植物，对单子叶植物来说，常用的方法是基因枪法；对于动物细胞来说，常用的方法是显微注射技术。,解析,2.(2017福建厦门一中期中)下列关于目的基因导入微生物细胞的叙述中，不正确的是 A.常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少等 B.受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态 C.感受态细胞吸收DNA
15、分子需要适宜的温度和酸碱度 D.常用生理盐水处理细胞，使其处于感受态,答案,解析,1,2,3,4,5,解析 因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少，故常用原核生物作为受体细胞；Ca2处理后细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态，感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度；常用Ca2处理细胞，使其处于感受态。,1,2,3,4,5,1,2,3,4,5,3.(2017广东潮南实验学校高二月考)在基因诊断技术中，所用的探针DNA分子中必须存在一定量的荧光分子或放射性同位素，后者的作用是 A.为形成杂交DNA分子提供能量 B.引起探针DNA产生不定向的基因突变 C.作为探
16、针DNA的示踪元素 D.增加探针DNA的相对分子质量,答案,解析 DNA探针是指用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子，放射性同位素的作用是作为探针DNA的示踪元素，C项正确。,解析,1,2,3,4,5,4.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因的常用方法是 A.DNA分子杂交技术 B.荧光分子标记技术 C.放射性同位素标记技术 D.显微注射技术,答案,解析 检测目的基因常采用DNA分子杂交技术，即在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素进行标记，以此作为基因探针，并使基因探针与基因组DNA杂交，若显示出杂交带，则表明目的基因已插入染色体DNA中。,解析,1,2,3,4,5,5.
17、(2016海南，31)基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题： (1)在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即_和从_中分离。,解析 获取目的基因主要有两大途径，即人工合成和从自然界已有的物种中分离。,答案,解析,人工合成,生物材料,1,2,3,4,5,(2)利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是_ _。,解析 在植物的成熟叶片中基因选择性表达，因此由所有RNA反转录形成的cDNA文库中只含有叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因。,答案,解析,cDNA文库中只含有
18、叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因,1,2,3,4,5,(3)在基因表达载体中，启动子是_识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是_。,解析 在基因表达载体中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，由于易于培养，最常选用大肠杆菌(或细菌)。,答案,解析,RNA聚合酶,大肠杆菌(或细菌),1,2,3,4,5,(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有_和_颗粒。,解析 将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉和钨粉颗粒。,答案,解析,金粉,钨粉,
