1、1考点 31 微生物的利用及在传统发酵技术中的应用直击考纲 1.微生物的分离和培养(B)。2.某种微生物数量的测定(C)。3.微生物的应用(B)。4.酶在洗涤等方面的应用(B)。5.制备和应用固相化酶(A)。6.发酵食品加工的基本方法(A)。7.实验：(1)探究酶在洗涤方面的作用(c)；(2)酵母细胞的固定化技术(b)；(3)腐乳的制作(a)；(4)果酒和果醋的制作(b)；(5)微生物的分离与培养(b)；(6)DNA 的粗提取与鉴定(b)。1微生物的培养2(1)无菌技术：主要包括消毒和灭菌。消毒方法：常用煮沸消毒法、巴氏消毒法。常用灭菌方法：灼烧灭菌接种环、接种针等金属器具；干热灭菌主要针对玻
2、璃器皿等；高压蒸汽灭菌主要针对培养基等。(2)倒平板操作操作过程如图所示，操作时要待培养基冷却至 50 左右时，在酒精灯火焰附近进行。制备固体培养基最后要将平板倒置，其主要目的是防止培养皿皿盖上的水珠滴入培养基造成污染。(3)平板划线操作(4)稀释涂布平板法：先将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。如图所示：2某种微生物的分离与计数(1)分离选择培养基培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。培养基中缺
3、乏氮源时，可以分离得到固氮微生物。3当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养能得到耐高温的微生物。(2)计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数a筛选菌株：利用以尿素为唯一氮源的选择培养基筛选菌株。b计数方法：活菌计数法和显微镜直接计数法。前者为了增强实验的说服力和准确性，需设置重复组，一般选择菌落数在 30300 的平板进行计数。c过程：土壤取样样品的稀释微生物的培养与观察。分解纤维素的微生物的分离a实验原理即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。b流程：土壤取样选择培养梯度稀释涂布平板挑选菌落。(
4、3)鉴定方法鉴定分解尿素的细菌含酚红指示剂的以尿素为唯一氮源的培养基细菌指示剂变红，则该菌能分解尿素鉴定纤维素分解菌3.微生物在传统发酵技术中的应用项目 果酒和果醋的制作 腐乳制作作用菌类果酒：酵母菌果醋：醋酸菌毛霉4原理酵母菌在无氧条件下将葡萄糖氧化成乙醇；醋酸菌在有氧条件下将乙醇氧化为醋酸毛霉将蛋白质、脂肪分解成小分子有机物原料选择 新鲜葡萄(或苹果) 豆腐实验流程冲洗 榨汁挑 选 葡 萄酒 精 发 酵 醋 酸 发 酵 果酒 果醋让豆腐上长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制操作注意事项材料选择与处理；防止发酵液污染，控制好发酵条件材料用量；防止杂菌污染；控制温度及酒精含量共同点都是天然的发酵
5、，利用了微生物新陈代谢过程中代谢产物的作用或直接获取代谢产物题组一 微生物的培养和利用1苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。某学校科研小组准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选出苯酚高效降解菌株。据图回答下列问题：(1)甲图中苯酚降解菌的富集培养基应含有蛋白胨、K 2HPO4、MgSO 4、苯酚和水，其中可作为碳源的有_。(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐_，以达到获得苯5酚高效降解菌的目的。应采用_法来进行该菌种的计数与分离，统计的菌落数往往比活菌的实际数目要_。(3)制备平板培养基时除了需要水、碳源、氮源、无机盐和特殊营养物质外，还
6、必须添加_。培养基的灭菌方法为_。(4)乙图为连续划线法示意图，在该图中_(填序号)区域最易获得单菌落。如需要长期保存该菌种，应采用甘油管藏的方法，保存温度为_。答案 (1)蛋白胨、苯酚 (2)增加(升高) 稀释涂布平板 小 (3)琼脂(凝固剂) 高压蒸汽灭菌 (4) 20 解析 微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。对异养微生物来说，含 C、N 的化合物既是碳源，也是氮源，即有些化合物作为营养要素成分时并不是起单一方面的作用。微生物常见的接种方法有：平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种、划线，在恒温箱里培养。
7、在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落；稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过一系列梯度稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。(1)培养基成分中的有机物均可以提供碳源，即蛋白胨、苯酚均可以作为碳源。(2)本实验的目的是筛选苯酚降解菌株，因此将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐增加，以达到富集苯酚降解菌的目的。甲图中采用的是稀释涂布平板法，以便于菌落计数与分离，用这种方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目要小，因为常常有两个或多个菌体连在一起生长繁殖而形成一个菌落的情况。(3)制备的平板培养基是固体培养基，除了需要水、
8、碳源、氮源、无机盐和特殊营养物质外，还必须添加琼脂作为凝固剂。培养基的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法。(4)图乙为平板划线法，随着划线次数的增加，菌种进一步被稀释，因此图中区域更易获得单菌落。长期保存该菌种，应采用甘油管藏的方法，保存温度为20 。2外卖在方便了大家的同时也存在着食品安全隐患，今年济南将启动外卖“食安封签” ，同时在餐饮企业的卫生测评指标中增加“微生物控制指数” 。回答下列问题：(1)微生物接种最常用的两种方法是_和稀释涂布平板法。这两种方法的所有操作都应在酒精灯火焰附近进行，目的是_。用前种方法若要在五个区域划线，共需灼烧接种环_次。(2)用稀释涂布平板法对细菌进行计数时，所统计的
9、菌落数往往会比实际数目偏小，原因是6_。在 5 个平板上各接种稀释倍数为 103的菌液样品 0.1 mL，培养一段时间后，平板上的菌落数分别为 48、50、52、54、330，则每升原菌液样品中细菌数为_个。(3)为防止人员感染和污染环境，实验人员离开实验室时，一定要做的事情有_、_。答案 (1)平板划线法 避免周围环境中微生物的污染 6 (2)当两个或多个细胞连在一起时，平板上只能观察到一个菌落 5.110 8 (3)洗手(或用酒精对手消毒等) 对使用过的培养基进行灭菌处理后再丢弃解析 微生物接种最常用的两种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。两种方法均可用于菌种的分离纯化，但若要对菌液中含有
10、的活菌数进行计数，则只能用稀释涂布平板法，但这种方法得到的结果往往比实际结果偏低，原因是涂布时可能存在两个或多个细菌连在一起而形成一个菌落。其计算方法是：单位菌液中含有的细菌数菌落数的平均值涂布菌液的体积稀释倍数。(1)微生物接种最常用的两种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。两种方法的所有操作都应在酒精灯火焰附近进行，目的是避免周围环境中微生物的污染。每次接种前后接种环都需要灼烧灭菌，因此若要在五个区域划线，共需灼烧接种环 6 次。(2)用稀释涂布平板法对细菌进行计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上只能观察到一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目小。观察数据发现 330 与其他数
11、值相比明显偏高，证明此平板已被污染，此数值应该舍弃，其他四个培养基上平均数(48505254)/451，所以每升水样中活菌数为 511030.1103 5.110 8(个)。(3)实验人员离开实验室时，一定要洗手(用酒精对手消毒等)，以防止被微生物感染，对使用过的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。题组二 传统发酵技术的应用3(2018启东中学一模)腐乳是我国古代劳动人民创造出的一种经过微生物发酵的大豆食品。它“闻着臭，吃着香”且易于消化吸收，深受大众喜爱，其制作方法广为流传。请回答下列有关问题：(1)现代科学研究表明，许多种微生物参与了豆腐的发酵，其中起主要作用的是_，它与乳酸菌在
12、结构上的主要区别是_7_。(2)腐乳易被人体吸收是因为豆腐中的成分发生了如下变化：_。(3)在腐乳制作过程中会加盐腌制，加盐的作用是_。越接近瓶口加盐量越多的原因是_。(4)防止杂菌污染是制作腐乳过程中的一项重要的操作，请再列举一项防止杂菌污染的操作：_。(5)在腐乳制作过程中会遇到许多问题，请你提出一个科学合理且可供研究的课题。_。答案 (1)毛霉 毛霉有由核膜包被的细胞核而乳酸菌没有 (2)豆腐中的蛋白质在蛋白酶的催化下分解成小分子的肽和氨基酸，豆腐中的脂肪在脂肪酶的催化下分解成甘油和脂肪酸 (3)析出豆腐中的水分使豆腐变硬，抑制微生物的生长避免豆腐变质 越接近瓶口，杂菌污染的可能性越大
13、(4)装瓶时操作要迅速、小心 (5)探究制作腐乳的最佳湿度解析 (1)腐乳制作有多种微生物参与，其中起主要作用的是毛霉。毛霉属于真核生物，而乳酸菌属于原核生物，因此毛霉与乳酸菌在结构上的主要区别是：毛霉有由核膜包被的细胞核，而乳酸菌没有。(2)腐乳易被人体吸收是因为豆腐中的成分发生了如下变化：豆腐中的蛋白质在蛋白酶的催化下分解成小分子的肽和氨基酸；豆腐中的脂肪在脂肪酶的催化下分解成甘油和脂肪酸。(3)制作腐乳的过程中，加盐可以析出豆腐中的水分使豆腐块变硬，在后期的制作过程中不会过早酥烂；同时，盐能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。越接近瓶口，杂菌污染的可能性越大，因此要随着豆腐层的加高增加
14、盐的用量。(4)在腐乳制作过程中为防止杂菌污染，用来腌制腐乳的玻璃瓶洗刷干净后要用沸水消毒，除此之外，装瓶时操作要迅速、小心；整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封；封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。(5)在腐乳制作过程中，盐的浓度、温度、湿度等都会影响腐乳的品质，因此可供研究的课题有：探究制作腐乳的最佳湿度、探究制作腐乳的最佳温度等。4用百香果作材料制成的果醋具有缓解压力、消除疲劳、延缓衰老、预防动脉硬化、养颜美容的功效。如图为百香果醋的制作流程图，请回答下列相关问题：8(1)过程的酿造原理是先使酵母菌进行_，以增加酵母菌的数量，然后通过_获得果酒。(2)酿制百香
15、果酒时，并不需要对百香果进行严格的消毒处理，这是因为在_的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物因无法适应这一环境而受到抑制。过程往往不能长时间密封，原因是_。(3)过程适宜的温度为_。温度过高时，醋酸菌代谢减慢甚至死亡，根本原因是_。(4)过程转入过程前，除改变温度外，还需调整的发酵条件是_。要鉴定百香果醋是否酿制成功，除可以通过观察菌膜、尝、嗅之外，还可以通过检测和比较_做进一步的鉴定。答案 (1)有氧呼吸 无氧呼吸 (2)缺氧、呈酸性 酵母菌无氧呼吸产生 CO2，会使得装置气压增大 (3)3035 温度过高，影响酶的活性 (4)通入无菌空气 醋酸发酵前后的 pH解析 (1)在
16、果酒发酵过程中首先让酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，再进行无氧呼吸产生酒精。(2)酿制百香果酒时，在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物因无法适应这一环境而受到抑制，所以不需要对百香果进行严格的消毒处理。酵母菌无氧呼吸产生酒精和 CO2，CO 2会使装置气压增大，应及时放气。(3)醋酸菌的最适生长温度为 3035 ，温度主要影响酶的活性。(4)醋酸菌是需氧型细菌，发酵时需要通入无菌空气。可以通过检测和比较醋酸发酵前后的 pH 来进一步鉴定果醋是否酿制成功。5在白酒发酵的窖池中，当培养液的 pH4.5 时，酵母菌的代谢活动逐渐受到抑制，甚至停止。耐酸性酵母菌能在 pH3.
17、5 的环境下继续表现出较强发酵能力，适宜作白酒发酵生产用菌种。为选育适合白酒生产的耐酸性强的酵母菌，研究者进行了相关实验，请回答下列有关问题：(1)在发酵过程中，窖池中培养液的 pH 会逐渐下降，原因是_。(2)取窖底泥，溶于 10 mL 无菌水中，再取 1 mL 上清液接入一定量的麦芽汁培养基中培养，其目的是_，2 天后分别接种到不同酸碱度的麦芽汁培养基上，培养结果见下表。为选择合适的菌种，根据培养结果，可从表格中 pH 范围为_的培9养基中获得菌种。pH5 pH4 pH3 pH2.5 pH2 注：“”越多表示菌体长得越好。(3)通过如图所示_法进行纯化培养，取最终的酵母菌稀释液 0.1 m
18、L 滴在培养基上进行涂布，要将涂布器_后才能进行操作。在恒温培养箱中培养一段时间后，其中某组的 3 个平板上菌落数分别为 99 个、92 个、94 个，则可以推测每毫升酵母菌液中含菌数为_个。运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小，原因是_。(4)实验获得了三个耐酸性较强的酵母菌菌株，特点如下表。菌株 A B C特点pH3.5 时，生长代谢正常、优于其他常规菌种pH3.5 时，生长代谢正常，pH 46 时不正常pH 2.56，生长代谢正常、优于其他常规菌种依据菌株特点，研究者认为_菌株更适合作为白酒发酵菌株，作出这一判断的理由是_。答案 (1)酵母菌细胞呼吸产生 CO2，可形成碳酸，代谢过程还
19、产生了其他酸性物质 (2)使酵母菌大量繁殖 23 (3)稀释涂布平板 灼烧冷却 9.510 8 有的菌落可能是由 2个或多个菌体形成的 (4)C 该菌对 pH 的耐受范围更大，发酵初期 pH 近中性，C 菌种适合此环境，更易于形成优势菌群；发酵后期 pH 逐渐降低，C 菌种依然能正常生长(答案合理即可)10解析 (1)在发酵过程中，导致窖池中培养液的 pH 逐渐下降的原因有：酵母菌进行细胞呼吸产生 CO2，在培养液中形成碳酸；代谢过程还产生了其他酸性物质。(2)将上清液接入一定量的麦芽汁培养基中培养的目的是让酵母菌大量繁殖。由于筛选的酵母菌必须能在pH3.5 的环境下继续表现出较强发酵能力，因
20、此可从表格中 pH 范围为 23 的培养基中获得菌种。(3)将酵母菌稀释液 0.1 mL 滴在培养基上进行涂布的接种方法是稀释涂布平板法。为防止杂菌污染，进行操作前应将涂布器灼烧灭菌，待冷却后再进行涂布；根据题意，每个平板上的平均菌落数 95(个)，培养液的稀释倍数为 106，因此，每毫99 92 943升酵母菌液中含菌数950110 69.510 8(个)。由于平板上有的菌落可能是由 2 个或多个菌体形成的，所以，运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小。(4)依据菌株特点，C 菌株更适合作为白酒发酵菌株。因为该菌对 pH 的耐受范围更大，发酵初期 pH 近中性，C菌种适合此环境，更易于形成优势菌群；发酵后期 pH 逐渐降低，C 菌种依然能正常生长。
