1、 ICS 65.160 B 35 DB52 贵州省地方标准 DB52/T 13092018 烟草及烟草制品 非挥发性有机酸的测定 气相色谱法 Tobacco and tobacco productsDetermination of non-volatile orga nic acidsGas chromatography method 2018 - 08 - 13 发布 2019 - 02 - 13 实施 贵州省质量技术监督局 发布 DB52/T 13092018 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 原理 . 1 4 试剂 . 1 5 仪器及材料
2、. . 2 6 样品制备 . . 2 7 分析步骤 . . 2 8 回收率、 精密度和检测限 . . 3 9 检测报告 . . 4 附录 A（资料性附录） 非挥发性有机酸标准物质和样品的色谱图示例 . 5 DB52/T 13092018 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。 请注意：本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中国烟草总公司贵州省公司提出并归口。 本标准起草单位：贵州省烟草科学研究院、中国烟草总公司贵州省公司、贵州省标准化院。 本标准主要起草人：蔡凯、雷波、郭庆华、夏范
3、讲、赵会纳、向章敏、潘文杰、许冬青、赵瑞娟、 孙元飞、王小庭、张继胜。 DB52/T 13092018 1 烟草及烟草制品 非挥发性有 机酸的测定 气相色谱法 1 范围 本标准规定了烟草和烟草制品中非挥发性有机酸（草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻 酸及硬脂酸）的气相色谱测定方法。 本标准适用于烟草和烟草制品中非挥发性有机酸（草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻 酸及硬脂酸）的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 668
4、2 分析实验室用水规格和试验方法 YC/T 31 烟草及烟草制品 试样的制备和水分测定 烘箱法 3 原理 以己二酸为内标物质，10 %（体积分数）硫酸-甲醇溶液在常温（25 左右）条件下甲酯化非挥发 性有机酸（草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸），然后二氯甲烷对甲酯化产物 进行萃取，将萃取液直接采用气相色谱-火焰离子化检测器测定。 4 试剂 4.1 草酸，含量97 %（质量分数）。 4.2 苹果酸，含量97 %（质量分数）。 4.3 柠檬酸，含量97 %（质量分数）。 4.4 棕榈酸，含量97 %（质量分数）。 4.5 亚油酸，含量97 %（质量分数）。 4.6 亚麻酸，含量
5、97 %（质量分数）。 4.7 硬脂酸，含量97 %（质量分数）。 4.8 己二酸，含量97 %（质量分数）。 4.9 浓硫酸，含量95 %（质量分数）。 4.10 甲酯化溶液：10 %（体积分数）硫酸-甲醇溶液 。 4.11 实验室用水按照 GB/T 6682 执行。 4.12 甲醇，二氯甲烷，分析纯试剂。 DB52/T 13092018 2 4.13 标准溶液包括以下两种： a) 标准物质标准储备液：分别称取约 1000 mg 草酸（4.1）、2500 mg 苹果酸（4.2）、500 mg 柠 檬酸（4.3）、150 mg 棕榈酸（4.4）、150 mg 亚油酸（4.5）、350 mg 亚
6、麻酸（4.6）及 100 mg 硬脂酸（4.7）于 100 mL 容量瓶中，先用 80 ml90 mL 甲醇（4.10）溶解，超声溶解 5 min， 静置后定容，分别得到约 10 mg/mL、25 mg/mL、5 mg/mL、1.5 mg/mL、1.5 mg/mL、3.5 mg/mL 和1.0 mg/mL的草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸标准储备液。冷藏 于4 保存，有效期 3个月。取用时，放置于常温下，达到常温后方可使用； b) 内标物质标准储备液：称取约 1000 mg 己二酸（4.8）于 100 mL 容量瓶中，先用 80 ml90 mL 甲醇（4.10）溶解，超声溶
7、解 5 min，静置后定容，得到约 10 mg/mL 的己二酸标准储备液。冷 藏于 4 保存，有效期 3 个月。取用时，放置于常温下，达到常温后方可使用。 5 仪器及材料 5.1 旋风式样品磨，40 目筛片。 5.2 分析天平，感量为 0.1 mg。 5.3 涡旋振荡器。 5.4 离心机。 5.5 尼龙针式滤头（0.22m）。 5.6 气相色谱仪，配置火焰离子化检测器。 5.7 色谱柱：5 %苯基-95 %二甲基聚硅氧烷固定相，规格为 60 m0.32 mm，0.25m 膜厚。 6 样品制备 按照YC/T 31-1996执行制备烟草样品并测定水分含量。 7 分析步骤 7.1 样品处理 准确称取
8、过40目筛的100 mg烟末（精确至0.1 mg）于50 mL离心试管中，加入100 L己二酸内标标准 储备液和2.0 mL 10 %（体积分数）硫酸-甲醇溶液（4.10），旋紧旋盖，涡旋振荡2 min，常温（25 左 右）放置过夜甲酯化反应24 h 2 h。反应后加入5.0 mL去离子水（4.11），5.0 mL二氯甲烷（4.12）， 旋紧旋盖，涡旋振荡3 min后3000 rpm离心5 min，取下层有机相过0.22 m尼龙针式滤头后进行气相色谱 -火焰离子化检测器测定。 7.2 色谱分析 采用其他条件应验证其适用性，以下色谱分析条件供参考： a) 进样口温度：250 ，不分流； b) 进
9、样量：1 L； c) 氮气流速：2 mL/min，恒流模式； d) 柱温：40 下保持 5 min，然后以 5 /min 的速率升至 260 ，保持10 min； e) 检测器：火焰离子化检测器，检测器气体流量 N 2、H 2及O 2分别为 30、35 及 350 mL/min； 运行时间：59 min。 DB52/T 13092018 3 7.3 标准工作曲线 标准工作曲线的制作为分别吸取草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸标准储 备液（4.13.1）10 L、20 L、50 L、100 L、200 L、500 L于50 mL离心试管中，再分别加入 100 L己二酸内标标准储
10、备液（4.13.2），氮气吹干后，加入2.0 mL10 %（体积分数）硫酸-甲醇溶液， 旋紧旋盖，涡旋振荡2 min，常温（25 左右）放置过夜甲酯化反应24 h 2 h。反应后加入5.0 mL去 离子水，5.0 mL二氯甲烷，旋紧旋盖，涡旋振荡3 min后3000 rpm离心5 min，取下层有机相过0.22 m尼 龙针式滤头后进行气相色谱-火焰离子化检测器测定。以标准物质的峰面积/内标物质的峰面积为纵坐标 （Y），标准物质的质量/内标物质的质量为横坐标（X），拟合一元一次方程（Y=a+bX），分别得到草 酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸的标准工作曲线和相关性系数。一般来说
11、，相 关性系数（ R 2 ）大于0.999，则表明该标准工作曲线可靠。 7.4 样品测定 按照样品处理（7.1）与色谱分析（7.2）条件测定样品中的草酸、苹果酸、柠檬酸、棕榈酸、亚油 酸、亚麻酸及硬脂酸，根据保留时间定性，内标物质己二酸内标法定量。每个样品平行测定两次，非挥 发性有机酸标准物质和样品的色谱图参见附录A。 7.5 结果的计算与表述 样品中非挥发性有机酸的含量按照式（1）进行计算。 10001 wmb caY R .(1) 式中： R样品中非挥发性有机酸的含量，单位为毫克每克,（mg/g） ； Y样品中非挥发性有机酸与内标物质己二酸的峰面积比值； a非挥发性有机酸标准工作曲线的截距
12、； b非挥发性有机酸标准工作曲线的斜率； c加入样品中内标物质己二酸的质量，单位为微克,（g） ； m样品的质量，单位为克,（g） ； w样品中的水分含量， （%） 。 注：取两次平行测定值的平均值作为样品的测定结果，两次平行测定值之差除以平均值不应大于5 %，结果精确至 0.01 mg/g。每20个样品测定后应加入一个中等浓度的标准工作溶液，如果测定值与原值相差超过10 %，则应重 新进行标准工作曲线的制作。 8 回收率、精密度和检测限 本方法对七种非挥发性有机酸测定的回收率、精密度与检测限结果见表 1。 DB52/T 13092018 4 表1 七种非挥发性有机酸的回收率、精密度和检测限结
13、果 低添加量/n=5 中添加量/n=5 高添加量/n=5 有机 酸 实际含量 /mg/g 添加量 /mg/g 回收率 /% 添加量 /mg/g 回收率 /% 添加量 /mg/g 回收率 /% 相对标准 偏差/% 检出 限 / g/g 定量 限 / g/g 草酸 11.62 6.00 99.2 12.00 98.5 24.00 97.6 2.1 38 119 苹果 酸 58.44 30.00 98.5 60.00 97.8 100.00 97.2 1.5 35 110 柠檬 酸 4.69 2.00 101.4 4.50 100.3 9.00 99.4 1.8 30 94 棕榈 酸 1.65 1.
14、00 99.3 2.00 96.5 4.00 96.0 3.2 11 35 亚油 酸 1.44 0.70 102.9 1.40 96.7 2.80 95.9 4.3 15 47 亚麻 酸 2.88 1.50 99.3 3.00 95.3 6.00 96.4 2.5 18 56 硬脂 酸 0.48 0.30 103.3 0.60 96.7 1.20 95.8 4.4 12 38 9 检测报告 检验报告应包括以下内容： a) 识别被测样品需要的所有信息； b) 参照本标准所使用的试验方法； c) 检测结果，包括各单次测定结果及其平均值； d) 与本标准规定的分析步骤的差异； e) 在检测中观察到的
15、异常现象； f) 检测日期； g) 检测人员。 DB52/T 13092018 5 A A 附 录 A （资料性附录） 非挥发性有机酸标准物质和样品的色谱图示例 说明： 1草酸 11.43 min； 2苹果酸 21.38 min； 3内标己二酸 24.73 min； 4柠檬酸 30.64 min； 5棕榈酸 40.57 min； 6亚油酸 43.65 min； 7亚麻酸 43.94 min； 8硬脂酸 44.35 min。 图A.1 非挥发性有机酸标准物质（A）及样品（B）的分析色谱图 DB52/T 13092018 6 图 A.1 非挥发性有机酸标准物质（A）及样品（B）的分析色谱图（续） _ DB52/T 1309-2018
