1、 ICS 65.020.30 CCS B 43 13 河北省地方标准 DB13/T 63542026 畜禽粪便堆肥除臭菌筛选技术规程 2026-08-20 发布2026-09-20 实施河北省市场监督管理局发 布 DB13/T 63542026 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由河北省农业农村厅提出。本文件起草单位：河北工程大学、河北省畜牧总站等。本文件主要起草人：张鹤平、张伟涛、刘建钗、卢彦琦、郭伟婷、侯续文、李瑞芹、刘双、武向山、赵永国、刘艳莉、张良、刘瑞芬、吴志勇、刘猛、赵文玲、李洪艳、张雅倩、李维佳、韩艳
2、双、张佳茵。DB13/T 63542026 1 畜禽粪便堆肥除臭菌筛选技术规程 1 范围 本文件规定了畜禽粪便堆肥除臭菌筛选的术语和定义、样品采集、富集培养、菌株筛选、菌种保存等内容。本文件适用于畜禽粪便堆肥除臭菌的筛选。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 16489 水质 硫化物的测定 亚甲基蓝分光光度法 NY/T 4543 微生物肥料功能菌株筛选与鉴评通则 SL 89 硫化物的测定（亚甲蓝分光光度法）HJ 533
3、环境空气和废气 氨的测定 纳氏试剂分光光度法 HJ 535 水质 氨氮的测定 纳氏试剂分光光度 SN/T 2632 微生物菌种常规保藏技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。除臭菌 能够通过代谢活动减少或消除畜禽粪便堆肥产生的氨气、硫化氢、粪臭素、吲哚等臭味物质的微生物。4 样品采集 样品来源 样品宜采自养殖场、有机肥厂、林地和农田等场所。采样位置 4.2.1 从堆体表面以下 20 cm30 cm 处取样，若堆体高度1.0 m，可分层取样：上层（表面下 20 cm）、中层（堆体中央）、下层（距地面 20 cm 以上）。4.2.2 新鲜粪便取自表层下 5 cm 新鲜物料。4.2.3
4、 土壤取样采集 5 cm20 cm 耕层土壤。样品采集操作 参照NY/T 4543。5 富集培养 样品处理 取不同样品各10 g，充分打散混匀，放入含100 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，加入灭菌玻璃珠，于30、160 r/min恒温摇床中振荡培养2 h4 h。驯化富集 DB13/T 63542026 2 采用等梯度或浓度逐级增大的富集驯化方法，富集35次。培养基制备与溶液配制 见附录A。6 菌株筛选 分离纯化 采用稀释涂平板法，进行富集培养液中细菌、真菌、放线菌的分离。挑取不同形态单菌落，进行多次纯化得到纯菌株。菌株初筛 将分离纯化的菌株制成菌液，并以5%或10%（v/v）的接种量接种于
5、10 mL氨选择培养基、硫选择培养基中培养，定时测定溶液中氨氮、硫化氢去除率。将分离纯化的菌株分别接种于含有100 mg/L粪臭素、吲哚的无机盐固体培养基中，35恒温培养。生长菌株为初筛阳性菌株。菌株复筛 6.3.1 除氨菌、除硫菌复筛 取200 g畜禽粪便放入大烧杯中，将待测菌液按粪便质量体积比5%或10%（m/v）接种到粪便中，搅拌均匀，密封后放于培养箱中，30 发酵15 d。每隔3 d取吸收液，测定氨气、硫化氢浓度。氨去除率、硫化氢去除率高的菌株为候选菌株。6.3.2 粪臭素降解菌、吲哚降解菌的复筛 将菌株以5%或10%（v/v）的接种量接种于含50 mg/L粪臭素、吲哚的发酵培养基中，
6、30培养5 d，定时取样，检测粪臭素、吲哚的含量。降解率高的菌株为候选菌株。6.3.3 检测方法 6.3.3.1 样品处理 取上述样品1 ml加入10 ml甲醇中，40水浴加热30 min，定时每5 min涡旋3 min，12000 r/min离心20 min，收集上清液，0.22 m滤膜过滤，待测。6.3.3.2 检测条件 6.3.3.2.1 采用高效液相色谱法检测粪臭素及吲哚含量。色谱条件为：C18（2.150mm）色谱柱，柱温 30，检测波长为 265 nm，流速 0.6 mL/min，进样量 20 L。有机相为乙腈，水相为 0.1%甲酸溶液。梯度洗脱条件为：0 min，50%：50%；
7、10.5 min，27.5%：72.5%；12.5 min，10%：90%；14 min，10%：90%；15 min，27.5%：72.5%；16 min，27.5%：72.5%；17 min，50%：50%。6.3.3.2.2 将标准品母液梯度稀释为不同浓度待测液，测定标准曲线。在粪臭素、吲哚的检测方法下，吲哚的保留时间为 5.860 min，粪臭素的保留时间为 6.467 min。7 菌种保存 参照SN/T 2632执行。A ADB13/T 63542026 3 附录A （资料性）培养基制备与溶液配制 A.1 培养基制备 A.1.1 LB培养基 蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、Na
8、Cl 10.0 g、蒸馏水1000.0mL，pH7.07.4，121高压灭菌20 min。若用固体培养基则加20.0g琼脂。A.1.2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）马铃薯浸粉6.0 g、葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、蒸馏水1000.0 mL，pH 5.45.8，121高压灭菌20 min。若用固体培养基则加20.0 g琼脂。A.1.3 高氏一号培养基 FeSO47H2O 0.01 g、KNO3 1.0 g、KH2PO4 0.5 g、NaCl 0.5 g、MgSO47H2O 0.5g、可溶性淀粉20.0 g、蒸馏水1000.0 mL、pH 7.27.4。若用固体培养基则加20.0
9、g琼脂。A.1.4 无机盐培养基 Na2HPO47 H2O 12.8 g、KH2PO4 3.0 g、NH4Cl 1.0 g、NaCl 0.5 g、MgSO47 H2O 0.2 g、CaCl2 0.1 g、FeSO47 H2O 0.01 g、复合无机盐溶液0.5 mL（配制：EDTA 0.5 g/L、ZnSO4 0.01 g/L、硼酸0.03 g/L、MnCl 0.003 g/L、CuCl2 0.001 g/L、钼酸钠0.003 g/L，pH 7.07.4）、蒸馏水1000 mL，121高压灭菌20 min。固体培养基添加20.0 g琼脂。A.1.5 含氨富集培养基 蔗糖5.0 g、蛋白胨2.0
10、 g、KH2PO4 2.0 g、MgSO47H2O 0.5 g、NaCl 2.0 g、ZnSO4 0.05 g、FeSO4 0.04 g、蒸馏水1000.0 mL，pH 6.87.2，121高压灭菌20 min。氨水5.0 mL，滤膜过滤除菌，加入至灭菌后培养基，混匀。A.1.6 含硫富集培养基 NH4Cl 2.0 g、MgCl2 0.5 g、K2HPO4 3.0 g、CaCl26H2O 0.2 g、蒸馏水900.0 mL，pH 6.06.2，121高压灭菌20 min。Na2S9H2O 10.0 g，用100mL蒸馏水稀释，0.22um滤膜除菌，加入至灭菌后培养基，混匀。A.1.7 粪臭素富
11、集培养基 在无机盐培养基的基础上，梯度（10100 mg/L-1）增加粪臭素。A.1.8 吲哚富集培养基 在无机盐培养基的基础上，梯度（10100 mg/L-1）增加吲哚。A.1.9 氨选择培养基 CHNaO2HO 5.0 g、(NH)SO 0.45 g、KHPO 0.25 g、Fe(SO)0.0025 g、NaCl 0.125 g、MgSO7HO 0.06 g、MnSOHO 0.001 g、蒸馏水1000 mL、pH7.07.2，121高压灭菌20 min.A.1.10 硫选择培养基 NHCl 0.4 g、MgCl 0.2 g、KHPO3HO 2.0 g、NaCO 0.4 g、蒸馏水900.
12、0 mL，pH 6.06.2，121高压灭菌20 min。NaS9HO 0.1 g，用100mL蒸馏水稀释，滤膜除菌，高压后加入。A.1.11 粪臭素选择培养基 在灭菌后的无机盐培养基中加入过滤后的粪臭素母液。DB13/T 63542026 4 A.1.12 吲哚选择培养基 在灭菌后的无机盐培养基中加入过滤后的吲哚母液。A.1.13 发酵培养基 玉米秸秆粉2.0 g、蛋白胨1.0 g、（NH4）2SO4 0.4 g、KH2PO4 0.2 g、MgSO47 H2O 0.05 g、牛肉膏0.5 g，蒸馏水100.0 mL，pH 7.27.4，121高压灭菌20 min。A.2 溶液配制 A.2.1 粪臭素、吲哚标准储备液 分别称取0.1 g粪臭素、吲哚标准品定容于100.0 mL的甲醇中，充分混匀，0.22 m有机相滤膜过滤，置于棕色容量瓶，4避光保存。A.2.2 粪臭素、吲哚标准品母液（1mg/mL）分别称取10.0 mg粪臭素和吲哚标准品，移入10 mL棕色容量瓶，加入78 mL无水乙醇，涡旋并短时超声至完全溶解，用无水乙醇定容至10 mL，颠倒摇匀。使用0.22 m有机相滤膜过滤，置于棕色容量瓶，4避光保存。
