1、第9章 核酸探针标记 （label of nuclei acid probe ）,山东大学医学院免疫学研究所 张利宁,一、探针的类型,核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物标记的、能与特定的靶分子发生特异性相互作用的DNA或RNA片段。 1 基因组DNA探针：病毒DNA等 2 cDNA探针；最常用 3 寡核苷酸探针：10-50bp，测序、点突变 4 RNA探针：稳定性高、特异性强，但RNA极易降解，不宜操作。,二、探针的标记物,理想的标记物：敏感度高；特异性强；不影响探针分子的主要理化特性；标记、检测方法简单、探针保存时间长；对环境无污染、对人体无损害；价格低廉。 一）放射性标记物 二）非放
2、射性标记物,（一） 放射性标记物 -放射性核素,利用放射性核素能产生射线的特性将核素标记在核酸合成所必需的NTP或dNTP上，通过一定方法掺入到DNA 或RNA 中去制成探针，与待测的核酸杂交后，核素产生的或射线可使底片感光的特性，通过放射自显影的方法进行检测。 产生射线的核素：32P、3H、35S 产生射线的核素：125I,1、常用的放射性核素,1） 32P：产生射线，灵敏度高，分辨率强，是最常用的放射性标记物，但半衰期短（14。3天）：位和位标记。 2）35S：分辨率高、半衰期长（87。1天）。敏感度底O(S) O(S) O(S)OH- P-O-P-O-P-O-CH2 O 硷基O O O
3、H H(OH),2、放射性标记物的优缺点,优点：灵敏度高：0。01pg特异性强 缺点：放射性污染成本高、半衰期短，不能长期保存,二）非放射性标记物,1、优缺点 优点：无放射性污染成本低、操作简单 缺点：敏感性、特异性均低于放射性核 素,2、常用的标记物,1）生物素：1-2pg生物素化核苷酸：bio-16-dUTPbio-11-dUTP 生物素化核苷酸-通过酶触反应掺入到DNA中去制成探针-杂交-抗生物素蛋白-生物素-酶的复合物加底物显色 光敏生物素：生物素与光敏基团结合-光敏生物素-光敏生物素与核酸探针混合-在强光的作用下-光敏基团与核酸共价结合-生物素标记的 探针,生物素化的核苷酸和 光敏生
4、物素,生物素,光敏基团,2）地高辛甙元,Dig-dUTP-通过酶触反应掺入到DNA中去制成探针-杂交-加抗地高辛-酶的复合物加底物显色 灵敏度较高：0.1pg 特异性较生物素高 是较理想的非放射性标记物,三、探针的标记方法,（一）缺口翻译法或切口平移法 （二）随机引物法(三）末端标记法 （四）cDNA探针的标记 （五）RNA探针的标记,（一）缺口翻译法或切口平移（nick translation）,限量DNA酶I,DNA聚合酶I+ 32P-dNTP,变性,32P部分标记的单连DNA片段,5,3,3,5,5-3外切酶和5-3 内切酶,5,3,5,3 5,缺口翻译法的原理,限量DNase I在待标
5、记的双连DNA的每一条连上产生若干个单连缺口 利用E.coli DNA多聚酶I的5-3外切酶的活性和5-3多聚酶的活性，在缺口处5末端每切除一个核苷酸，则在3末端添加一个核苷酸，以修补缺口。 随着缺口在5末端的移动修饰的核苷酸就掺入到新合成的DNA连中,缺口翻译法的特点,1）快速、简便、标记的探针均一、特异性高 2）仅适用于较长的双连DNA 3）DNA多聚酶必须是E。Coli DNA多聚酶的全酶 4）DNA酶I的浓度一定要适宜,（二）随机引物法（random priming ),随机寡核苷酸引物（random primer)：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交
6、，起到聚合酶反应引物的作用 E。coli DNA聚合酶I的Klenow大片段（仅具有5-3多聚酶的活性，而无外切酶的活性）,随机引物法标记的原理,变性后的探针DNA或RNA与随机引物混合 随机引物按碱基互补的原则与模板DNA 的相应区域结合 DNA多聚酶I的Klenow大片段即从引物3-OH端开始合成互补DNA连 反应中若加入修饰的dNTP即可获得标记的DNA探针,5,3,3,双连DNA,变性,随机引物,Klenow大片段,32P-dNTP,3,5,变性,随机引物标记法,随机引物法的特点,1）不但可用于双连DNA的标记，而且 可用于单连DNA和RNA的标记 2）操作简单 3）标记率高,(三）末
7、端标记法,末端脱氧核苷酸转移酶法（terminal deoxynucleotide transferase) 5DNA3OH+-32 p-dNTP5_DNA_3(pdN)n +nPPi (焦磷酸） T4多核苷酸激酶法（method of T4 polynucleotide kinase),末端转移酶,(三）末端标记法,T多核苷酸激酶法（method of T4 polynucleotide kinase) 35OH +32P-P-PA(ATP）532P+PPA,T4多核苷酸激酶,三、探针的标记方法,（一）缺口翻译法或切口平移（nick translation） （二）随机引物法（random
8、priming )(三）末端标记法 （四）cDNA探针的标记（反转录制备单 连cDNA探针） （五）RNA探针的标记（体外转录的方法）,第10章 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization),基本原理：具有一定同原性的两条核酸单连在一定条件下（适当的温度、离子强度等），按硷基互补的原则，重新形成双连DNA的过程。 杂交的类型： 液相杂交：核酸电镜 固相杂交：膜固相印记杂交、组织细胞原 位杂交、菌落原位杂交,一、膜固相印记杂交,（一）固相支持物的选择、硝酸纤维素膜：在高离子强度下，具有较强的吸附单连DNA和RNA的能力：80-100ug/cm2、尼龙膜：在低离子强度下，
9、很强的吸附单连、双连的DNA或RNA；350-500ug/cm2,（二）杂交的基本过程：,变性 杂交 洗膜杂交信号的检测,、变性（Denaturation),热变性：95-100C , 5-10分钟碱变性：0.5Mol/L NaOH ,30分钟,、杂交（hybridization),变性的单连DNA按碱基配对的原则，在适当 的条件下重新缔合形成双连的过程。,建立杂交条件需要考虑的因素,）离子强度：x SSC ）杂交温度：杂交反应在低于Tm值15- 25 温度下进行 一般，探针长500bp，G+C含量为， 离子强度为x SSC；杂交液中不含甲酰胺，Tm 值为93。4，杂交温度68 ，含甲酰胺，T
10、m值为68。4 ，杂交温度42。4 ）减少非特异性杂交反应：预杂交,、洗膜,离子强度：0.1x SCC 洗膜温度：低于 Tm值 5-12 C 。 探针长500bp， G+C含量 42%,离子强度0.1xSSC, 不含甲跣胺， Tm值为67 ，则洗膜温度为55-62 .,4、杂交信号的检测,）放射性核素探针的检测：放射自显影 ）非放射性核素探针的检测地高辛标记探针的检测生物素标记探针的检测,地高辛标记探针的检测,抗地高辛抗体碱性磷酸酶复合物,底物（BCIP+NBT),紫色的不溶性化合物,生物素标记探针的检测,过氧化物酶, 底物（）,抗生物素蛋白,生物素,棕褐色不溶性的化合物,（三）膜固相杂交的类
11、型,、斑点及夹缝印迹杂交（dot blot and slot blot)：检测DNA或RNA（定性或半定量）,、Southern 印迹杂交(Southern blot)：,检测DNA大小、存在状态DNA电泳变性 转膜 杂交,吸水纸,玻璃板,重物,滤纸,凝胶,盐桥,Southern转印,3|、 Northern印迹杂交(Northern blot)：,检测RNA的大小和状态RNA电泳 转印 杂交 洗膜 显色,二、组织、细胞的原位杂交,用标记的核酸探针与组织切片或细胞涂片中的核酸进行杂交并对其进行检测和定位的方法,三、菌落与噬菌体斑的原位杂交,平皿,膜杂交,培养,第11章 PCR技术的原理和应用,
12、PCR：Polymerase chain reaction Mullis: 1983发明， 1993获诺贝尔奖 Sarki:1985将PCR用于镰刀红细胞贫血 的诊断。 Erlich: 分离纯化了适用于PCR的Tag酶,一、常规多聚酶连反应,（一）原理： PCR是体外酶促合成特异片段的方法。由高温变性、低温退火及适当温度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的得以迅速扩增。 变性-退火-延伸-延伸,30-35循环,94 c 55 c 72c,5,3,5,3,变性,退火,延伸,第二循环,（二）PCR 的特点,。操作简单 。省时：1-2 hr 。灵敏度高：pg 。特异性强 。对原始材料质量要求
13、低 。有一定程度的单核苷酸错误掺入,（三）影响的因素,、模板：ng量的克隆DNA或g的染色体DNA 、引物：特异性应强 、Mg2+浓度: 1.5-2 mmol/L量 、dNTP 的浓 度: 单核苷酸浓度 200umol/L 5、 Taq DNA聚合酶的用量:100l 反应液 中加入2。5U的酶 、循环参数：；25-35,PCR引物的设计,、上游引物与目的DNA端序列完全相同； 下游引物与目的DNA端序列互补 、引物长度以15-30个碱基为益；G+C含量为45-55 、避免引物内形成二级结构 、两引物间不应发生互补，特别是在端， 避免形成引物二聚体 、合成的引物应进行纯化 、引物的浓度不要太高:
14、 0.1-0.5 mol/L,引物的设计,目的：ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC CGC ACT TCG GAC-CTC CTA AGA CAC TCT CTA CAG-3 上游序列： ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC G+C=11/21=52% 下游序列：CTG TAG AGA GTG TCT TAG GAG-3 G+C=10/21=48%,二、反转录PCR （Reverse transcription PCR ，RT-PCT),反转录PCR：mRNA-cDNA-PCR 抽提RNA 反转录合成cDNA PCR 扩增,AAAAAAA-3,AAAAAA
15、A-3,TTTTTTT-5,mRNA,cDNA,TTTTTTT-5,PCR,RT-PCR,反转录酶+dNTP,cDNA,三、荧光实时定量PCR (fluorescence Quantified real time PCR),实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。下面就其定量原理、方法作一介绍。,实时荧光定量PCR原理,所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实
16、时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,1. Ct 值的定义,C代表Cycle（循环数）t代表threshold（荧光域值）CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到 达设定的域值时所经用的循环数,Ct值的确定,横坐标：PCR循环数 纵坐标：荧光信号强度 黑线：荧光域值 红线：无模板-域值下一 直线 绿线 ：样品 CT值=17（第17个循环时，荧光信号强度达到域值）,2. 荧光域值（threshold）的设定,PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍，即：threshold = 10 SDcyc
17、le 3-15,3. Ct值与起始模板的关系,研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线（如下图所示）,荧光定量标准曲线,横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值.获得未知样品的Ct值-标准曲线-该样品的起始拷贝数。,4. 荧光化学,荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针荧光染料,1）TaqMan荧光探针：,用荧光基团标记PCR特异性荧光探针。 探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收-检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶的5
18、3外切酶活性将探针 酶切降解，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离荧光监测系统接收到荧光信号每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,TaqMan 荧光探针工作原理,2）SYBR荧光染料,在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料；SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,传统定量PCR方法： PCRELISA法,内参照法；竞争法 ； 原理：同一PCR管（荧光标记引物、待检模板、已定量内标） -该PCR管（扩增的模板、扩增的内标）-电
19、泳或高效液相分离-分别检测荧光强度-以内标为参照，定量检测模板,缺点-重现性差,传统定量方法都是终点检测（PCR到达平台 期后进行检测），而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。 加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。,图4. 相同模板在同一台 PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性,四、梯度PCR,利用梯度PCR仪对解链、退火及延伸设置温度梯度，适用
20、于摸索试验条件时，多次试验可在一台仪器上完成，既节省试验时间，提高效率，又节省试验成本。,五、巢式PCR（nested PCR）,巢式PCR（nested PCR）是一种PCR改良模式，它使用巢式PCR引物来增强反应的敏感性和特异性，巢式PCR方法由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成，在第一轮扩增中，使用一对外引物产生扩增产物，然后用一对内引物对第一轮扩增产物进行第二轮扩增。以上方法适用于多种DNA及RNA病毒的检测，如HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA、CMV DNA 、HTLV DNA、 HGV RNA等。,长PCR（Long range PCR）,27 kb fragments are possible from good quality genomic DNA, Taq DNA polymerase for high processivity (i.e. 5-3 polymerase activity) usually Pwo with 3-5 proofreading abilitiesThis combination of features allows longer primer extension than can be achieved with Taq alone.,
