1、第 十一 章 微生物的应用,第十章微 生 物 的食品应用,第一节 食 醋 第二节 酱 油 第三节 腐 乳 第四节 发酵乳制品 第五节 发酵酒类 第六节 氨基酸,第十章微 生 物 的食品应用,第一节 食 醋,菌种： 纹膜醋酸菌(Acetobacteraceti)、许氏醋酸菌(A.schutzenbachii)、恶臭醋酸菌(A.rances)混浊变种、巴氏醋酸菌(A.pasteurianus)巴氏亚种。 反应过程： 醋酸菌在充分供氧的情况下生长繁殖，将乙醇氧化为醋酸。依据菌种的不同，还可产生其它有机酸及有香味的酯类等。 食醋生产的原料：高粱、大米、玉米、甘薯、糖糟、梨、柿、枣等含糖或含淀粉的果实等
2、。,食醋自古以来就是我国人民生活中的必需品。它是一种酸性调味料，除含有醋酸外，还含有糖分，氨基酸等营养物质，能增进人们的食欲。,食醋是细菌的发酵制品，通常是利用醋酸杆菌进行好氧发酵而产生； 如果以淀粉质为原料，还需要霉菌和酵母菌的参与； 如果以糖类物质为原料，需加入酵母菌； 只有以乙醇类物质为原料，才不需其它微生物参与，单用醋酸杆菌就可完成酿醋作用；下面我们以淀粉质为原料，介绍参与与酿造作用的有关微生物。,第十章微 生 物 的食品应用,一、菌 种,第十章微 生 物 的食品应用,2、酵母菌利用糖进行酒精发酵的菌种主要是酿酒酵母。 3、醋酸菌醋酸菌是醋酸发酵的主要菌种，它能氧化酒精为醋酸。醋酸菌的
3、形态为短杆或长杆细胞、单独、成对或排列成链状。不形成芽孢。革兰氏染色幼龄阴性，老龄不稳定。好氧。喜欢在含糖和酵母膏的培养基上生长。最适生长温度为30左右，最适pH值为5.46.3。,1、曲霉菌 酿醋先酿酒，酿酒先需糖。故以淀粉质为原料，首先必须将淀粉水解为葡萄糖，才能为酒精发酵提供条件。而完成这一生化过程是通过曲霉菌作用。 使用曲霉菌作为糖化剂的常用菌种是黑曲霉、宇佐美曲霉等。近年来，广泛使用的糖化菌种是北微所选育的黑曲霉变异株uv-11，编号为AS.3.4309。最适pH值为3.55.0。,根据对维生素的要求和对有机酸的同化性能等区别，食醋酿造菌种可分为2个属：醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属。醋酸
4、杆菌属现已发现53种。它们的特点是：能氧化乙醇成醋酸，有些可继续氧化成CO2和水；不氧化葡萄糖；不要求维生素；能同化主要有机酸。 葡萄糖杆菌属发现有8个种，它们的特点是：能氧化乙醇成醋酸，但氧化能力很弱，并且不再分解醋酸生成CO2和水；能氧化葡萄糖或葡萄糖酸；需要维生素；对主要有机酸几乎不能同化。,第十章微 生 物 的食品应用,目前国内外用于生产食醋的菌种有：奥尔兰醋杆菌（Acetobacter orleanense）、许氏醋杆菌（A. schutzenbachii）、弯醋杆菌（A. curvum）、产醋醋杆菌（A. acetigenum）、醋化醋杆菌（A. aceti）、恶臭醋杆菌（A. r
5、ancens）等。我国目前使用人工纯培养的醋酸菌种，主要有二株：一株是中科院微生物研究所培育出的恶臭醋酸杆菌AS.1.41。另一株是上海酿造研究所和上海醋厂从丹东速酿醋中分离而得，编号为沪酿1.01。,第十章微 生 物 的食品应用,1.淀粉糖化曲霉菌能分泌多种淀粉酶，完成淀粉糖化作用。2、酒精发酵这一过程是利用酵母菌在无氧条件下经EMP途径，将葡萄糖发酵成乙醇和CO2。 3、醋酸发酵乙醇在醋酸菌的作用下氧化成乙酸，这个过程称为醋酸发酵。它是食醋生产的主要环节。乙醇氧化过程可分为两个阶段：首先，乙醇在乙醇脱氢酶的催化下氧化成乙醛。然后，乙醛在乙醛脱氢酶作用下，氧化成乙酸,第十章微 生 物 的食品
6、应用,二、发酵机理,4、食醋的色、香、味 （1）食醋色素 食醋生产如使用红曲做糖化剂，则红曲霉色素赋予食醋红色。食醋在发酵过程中，主要通过美拉德反应和酶褐变反应生成色素。 （2）食醋香气 发酵过程中产生各种有机酸和醇类，通过酯化反应合成各种酯类，赋于食醋以特殊的香气。酯类以乙酸乙酯为主。 （3）食醋的味 酸味：醋酸是形成酸味的主体酸。 甜味：由糖分组成。 鲜味：来源于蛋白质的水解产物氨基酸和菌体自溶核酸的降解物核苷酸。 咸味：来自食盐。,第十章微 生 物 的食品应用,酱油是我国传统的发酵食品之一，在我国有着悠久的历史，酱油不仅营养丰富，含有糖份、多肽、氨基酸、维生素、食盐和水等物质，而且赋予食
7、品以咸味、鲜味、香味和颜色，增进人们的食欲，因而是人们生活中不可缺少的调味品。随着世界上食用酱油的人数增加，对酱油的需要量也随之增加，同时，对酱油的质量也会提出更高的要求。因此，酱油酿造工业在食品工业中的地位愈加显得重要。,第二节 酱 油,一、概述,酱油是多种微生物混合作用的结果。霉菌、酵母和细菌都参与了复杂的物质转化过程。其中对原料发酵快慢、成品颜色浓淡、味道鲜美程度有直接关系的微生物是米曲霉和酱油曲霉；对酱油风味有直接关系的微生物是酵母菌和乳酸菌。1、米曲霉和酱油曲霉 酱油中应用的曲霉菌主要是米曲霉（Aspergillus oryzae）和酱油曲霉（A. sojae）。 米曲霉菌落生长很快
8、，初为白色，渐变黄色。分生孢子成熟后，成黄绿色。分生孢子头为放射形、顶囊球形或瓶形。小梗一般为单层，偶有双层。分生孢子为球形，粗糙或近于光滑。 米曲霉能利用单糖、双糖、有机酸、醇类、淀粉等多种碳源。在生长过程中，需要一些氮源，好氧。最适生长温度约在35左右。pH值为6.0左右； 米曲霉有着复杂的酶系统，主要有蛋白酶，分解原料中的蛋白质；谷氨酰胺酶，使大豆蛋白质水解出来的谷氨酰胺直接分解生成谷氨酸，增强酱油的鲜味；淀粉酶，分解原料中的淀粉生成糊精和葡萄糖；此外它还能分泌果胶酶、半纤维素酶和酯酶等。但最重要的是蛋白酶，其次是淀粉酶和谷氨酸酰胺酶。它们决定着原料的利用率、酱醪发酵成熟的时间以及产品的
9、味道和色泽。,二、菌种,酱油曲霉是日本学者坂口在30年代从酱油中分离出来的，并应用于酱油生 产。酱油曲霉分生孢子表面有小突起，米曲霉-淀粉酶活性较高，而酱油曲霉体内含多聚半乳糖醛酸酶较高。 目前，日本制曲使用的是混合曲霉，其中米曲霉占79%，酱油曲霉占21%。我国则使用纯米曲霉菌种。广泛使用的菌种是米曲霉3.042，该菌株的特点是：蛋白酶活力高，比原菌种3.863提高30%，生长繁殖速度快，制曲时间由原来48h缩短到2228h；原料出品率提高5%以上；抗杂菌能力强，酱油的香气和滋味均优良；不产生黄曲霉毒素等。后来他们又对以UE336菌种为出发菌株，经亚硝酸、快中子、乙基磺酸甲烷、秋水仙碱等交替
10、诱变，筛选出谷氨酰胺酶活力比对照菌种提高2倍以上的菌种沪酿422号，在同等发酵条件下，谷氨酸含量提高40%左右，并不含黄曲霉毒素B1。,2、酵母菌从酱醪中分离出的酵母有7个属，23个种。其基本形态是圆形、卵圆形、柠檬形、腊肠形等。最适生长温度为2830，pH值在4.55.6之间合适。与酱油质量关系非常密切的酵母菌是鲁氏酵母、易变球拟酵母、埃契氏球拟酵母、无名球拟酵母等。在这当中，又以鲁氏酵母影响最为重要。它占酵母总数的45%左右，由空气中自然接种。它是常见的耐高渗透压酵母，能在18%食盐的基质中繁殖。它能发酵葡萄糖等生成乙醇、甘油等，从而进一步生成酯、糖醇等。增加了酱油的风味。它是发酵型酵母，
11、出现在主发酵期。随着发酵温度增高，在后发酵期，鲁氏酵母开始自溶，促进了易变球拟酵母和埃契氏球拟酵母的生长。它们是酯香型酵母，参与酱醪的成熟，生成烷基苯酚类香味物质，如4-乙基苯酚等，改善了酱油的风味。,3、乳酸菌从酱醪中分离出的细菌有6个属18个种。和酱油发酵关系最为密切的是乳酸菌。其菌体杆状、球形、分散或成链状。对氧要求不一。在乳酸菌中，酱油四联球菌、嗜盐片球菌、酱油片球菌与酱油风味形成有密切关系。在酱醪发酵过程中，前期嗜盐片球菌多，后期四联球菌多些。乳酸菌的作用是利用糖产生乳酸，和乙醇作用生成乳酸乙酯，香气很浓。由于产生乳酸，降低了发酵醪的pH值，使醪的pH值在5左右，这样就促进了鲁氏酵母
12、的繁殖。乳酸菌和酵母菌联合作用，赋予酱油特殊的香气。根据经验，如果乳酸菌数与酵母菌数之比为10:1时，效果最好。 近年来，又发现某些芽孢杆菌也参与了酱油的酿造，而且是影响风味的主要因素。,酿造酱油的过程，实际上是多种微生物的协同作战的过程，通过这些微生物产生的酶的催化作用，将原料中的大分子有机物逐步分解为简单物质，再经过复杂的物理化学和生物化学的反应，就形成了具有独特风味的调味副食品酱油。目前已知酱油的化学成分多达三四百种，这些物质都是在这个复杂的变化过程中产生的。原料中的蛋白质经过由米曲霉所分泌的蛋白酶作用，逐渐分解成、胨、多肽和氨基酸。,三、机理,米曲霉分泌的蛋白酶可分为3种：酸性蛋白酶（
13、最适pH值为3）、中性蛋白酶（最适pH值为7左右）、碱性蛋白酶（最适pH值为8）。其中以碱性蛋白酶最多。故在酱油发酵过程中，如果pH值过低，会影响蛋白质的水解。米曲霉中外肽酶活力高于其它曲霉，故有利于氨基酸的生成。米曲霉中分泌的谷氨酰胺酶分解原料中的游离的谷氨酰胺，生成谷氨酸。原料中的淀粉质经过米曲霉产生的淀粉酶的糖化作用，水解成糊精和葡萄糖。米曲霉分泌的淀粉酶主要有-淀粉酶；分解淀粉的-1，4葡萄糖苷键，生成麦芽糖、糊精和少量葡萄糖；淀粉-1.4、1.6 -葡萄糖苷酶，能把淀粉分解成单个葡萄糖分子。分解下来的单糖类或其它糖类，有的作为微生物的碳源被利用；有的是成为形成酱色的重要成分；有的残留
14、在酱油中，给酱油以甜味，增加粘稠度。,酱油中含有多种高级脂肪酸，其中最重要的有乳酸、醋酸、玻珀酸、葡萄糖酸等。乳酸是由乳酸菌利用葡萄糖进行发酵而来。乳酸菌还可利用五碳糖（阿拉伯糖和木糖）发酵生成乳酸和醋酸。琥珀酸或经TCA循环或经谷氨酸氧化产生；某些醋酸菌能将葡萄糖氧化成葡萄糖酸；酱油中其它的甲酸等是经相应的醛类氧化而来。这些有机酸是酱油的重要呈味物质，又是酱油香气的重要组分。酵母菌的酒清发酵生成的乙醇，由氨基酸脱氨、脱羧后形成的少一个碳原子的高级醇，构成了酯类的前体物质。由发酵过程中产生的酯类以及由化学反应形成的酯类，构成了酱油香气成分的主体。香气的成分非常复杂，据目前分析，有276种成分。
15、,关于酱油色素的形成，目前一般认为有2个途径：第一个途径是经过美拉德反应（mai-llard reaction）。它是氨基化合物和羰基化合物之间的氨基-羰基反应。分为初始、中间和终了三个阶段，最终形成褐色物质类黑色素，这是最主要的生成途径：第二个途径是经过酶褐变反应，由曲生成的多酚氧化酶将蛋白质的水解产物酪氨酸氧化成黑色素。关于酱油的五味，一般认为：鲜味来源于氨基酸和核酸类物质的钠盐；甜味主要来源于糖类、某些氨基酸（甘氨酸等）、醇类（如甘油等）；酸味来源于有机酸；苦味来源于某些氨基酸（如酪氨酸等）、乙醛等；咸味主要来源于食盐。,1、曲霉污染有些原料本身发霉，或在发酵过程中污染了某些曲霉菌；其中
16、有些曲霉能产生黄曲霉毒素；有些生产菌种也能产生黄曲霉毒素。 2、细菌污染酱油中卫生指标规定，细菌数每ml不超过5万个。其中大肠杆菌最近似值，100ml不得超过30个。不得检出致病菌。如果超过标准，则表示发生污染。这种污染主要来源于种曲、容器等，也可能与污染粪便有关。,四 影响酱油质量的微生物,酱油生“花”是污染耐盐性产膜酵母所致。例如盐生接合酵母（Zygosaccharonycesalsus） 、日本接合酵母（Z. jqponicus）、粉状毕赤氏酵母（Pichia farinosa）、球拟酵母属（Torulopsis）和醭酵母属（Mycoderma）中的某些种等。酱油生“花”是由于浓度过稀、
17、成熟不完全、含糖过多、食盐不足、杀菌不彻底或容器不清洁所引起。酱油生霉后，质量下降，成分变坏，糖分和全氮减少，香气消失，鲜味减弱，并产生臭味、苦涩味。有人对江苏省镇江地区11个县、市的11个厂家生产的各类酱油进行了霉菌污染检查，结果在25份样品中，青霉检出率为60%（15份）、曲霉为48%（12份）、镰刀菌为24%（6份）。这些菌种中大部分可产生毒素，直接影响人体的健康。,3、酱油生“花”,腐乳以前都是靠自然发霉法。这种方法周期长，受季节性影响，而且容易污染。目前多采用人工纯种培养，大大缩短了生产周期，而且不易污染，常年都可生产。现在用于腐乳发霉的菌种有腐乳毛霉、鲁氏毛霉，五通桥毛霉、总状毛霉
18、、华根霉。另外在细菌型腐乳中，克东腐乳是利用微球菌属中的种进行酿造。武汉腐乳是利用枯草杆菌进行酿造的。,第三节 腐 乳,腐乳为我国著名的传统发酵食品，有1000多年的制造历史。它味道鲜美，营养丰富，价格便宜，因而受到人们的欢迎。,一、菌 种,腐乳的酿造过程，是几种微生物及其所产生的酶的不断作用的过程。在发酵前期，主要是毛霉等的生长发育期，在豆乳坯周围布满菌丝，同时分泌各种酶，引起豆乳中少量淀粉的糖化和蛋白质的逐步降解。此时由外界来到坯上的细菌、酵母也随之繁殖，参与发酵。加入食盐、红曲、黄酒等辅料，装坛后，即进行厌氧的后发酵。毛霉产生的蛋白酶和细菌、酵母的发酵作用，经过复杂的生物化学变化，将蛋白
19、质分解为蛋白胨、多肽和氨基酸等物质。同时生成一些有机酸、醇类、酯类，最后制成具有特殊色、香、味的腐乳成品。,二、机 理,（三）工艺流程腐乳的制作工艺比较简单，一般分为3个阶段：（1）制豆腐坯 （2）人工发霉 （3）装坛发酵,红曲是制造红腐乳不可缺少的配料。红曲霉色素是天然色素，使用安全。它是由红曲霉属的一些种经固体或液体培养产生的色素，通常是几种不同结构的色素的混和物。红曲霉色素包括红曲霉素、红曲霉红素、红曲霉黄素和红斑红曲霉素等几种色素。红曲霉的菌丝分隔，初为白色，后逐渐变为红色或紫色。它既产生分生孢子，也产生子囊孢子。腐生菌，嗜酸，耐高温（3547），耐乙醇（410%），能利用多种碳源，本
20、身能合成多种维生素，抗杂菌污染能力强。,第十章微 生 物 的食品应用,第四节 发酵乳制品,发酵乳制品的种类：酸制奶油、干酪、酸牛乳、嗜酸菌乳、马奶酒等。 常用的乳酸菌：干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸乳杆菌、乳酸乳球菌、乳脂乳球菌、嗜热链球菌等。 反应过程：乳酸菌分解乳糖进行同型乳酸发酵或异型乳酸发酵。 注意事项：在整个加工过程中，对原料灭菌处理采用的温度较低，所以接种剂量要大，以防止污染。,以牛奶为原料，经微生物发酵，可以制得许多发酵乳制品。例如酸牛奶、酸奶油、干酪和酸乳酒等。（一）菌种用于发酵乳制品的菌种，主要是一类能产生乳酸的细菌。 乳酸细菌发酵糖类的
21、类型可分为两种：同型乳酸发酵和异型乳酸发酵。同型乳酸发酵，乳酸菌几乎能将全部葡萄糖转变为乳酸；异型乳酸发酵，乳酸菌除将葡萄糖转变为乳酸外还同时产生乙醇和CO2。能引起同型乳酸发酵的乳酸细菌称为同型乳酸菌，例如干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳链球菌等。能引起异型乳酸发酵的乳酸细菌称为异型乳酸菌。例如嗜柠檬酸明串珠菌和葡聚糖明串球菌等。,一、发酵乳制品,从形状上分，乳酸细菌可分为乳酸球菌和乳酸杆菌二类。 乳酸球菌按照形态构造和生化反应特征的不同可归属于三个属：链球菌属、片球菌属和明串珠菌属。前两个属中的乳酸球菌都进行同型乳酸发酵。后一属中的乳酸菌则进行异型乳酸发酵。所有的乳酸杆菌都归属于一个属：乳杆
22、菌属。这一属的乳酸菌发酵葡萄糖的类型不定。所有的乳酸细菌通常是不运动的。不形成芽孢。兼性厌氧，罕见色素，营养要求复杂。在固体培养基上形成的菌落较小。它们对酸具有高度的耐性。,（二）乳制品的发酵1、酸性奶油（sour cream）酸性奶油是将稀奶油消毒杀菌后，接种发酵菌剂，在一定的条件下，经过复杂的生物化学反应后而形成的产物。 目前常采用混合菌剂进行发酵。常用作酸性奶油的菌种是乳链球菌、乳脂（酪）链球菌、噬柠檬酸链球菌、丁二酮乳链球菌和噬柠檬酸明串珠菌等。乳链球菌和乳酪链球菌能使乳液中的柠檬酸分解为羟丁酮，然后氧化成具有芳香味的丁二酮。目前认为较好的奶油发酵剂一般含有乳链球菌、乳酪链球菌和丁二酮
23、乳链球菌三种菌的混合菌种。在德国、荷兰和丹麦，他们采用由等量的乳酪链球菌和糖乳链球菌，再加10%的噬柠檬酸链球菌所组成的混合菌种进行发酵。,由于在酸性奶油中含有一定量的乳酸，因而pH值较低，再者还存在相当数量的乳酸细菌，所以一般较为稳定。但是它们也常受到有害微生物的污染而影响其质量。这主要是由于以下原因所造成： （1）生产菌种爱到噬菌体的侵染，而使菌体发生裂解； （2）酸性奶油成品中，有时会有不同程度的其它杂菌存在。这些杂菌容易引起酸性奶油腐败变质。例如假单胞菌属和黄杆菌属中的某些菌种，可分解奶油中的脂肪和蛋白质，从而产生酸败臭味：一些霉菌和酵母能在其表面上繁殖，产生各种色斑。,2、酸牛奶（y
24、oghurt,sour milk）酸牛奶是一种新型的发酵乳制品，具有较高的营养价值和特殊风味，极易被身体吸收，还可起着一定的疗效作用，因而受到欢迎。酸牛奶是由优质鲜乳经脱脂（或不脱脂）、消毒后，接入乳酸发酵菌剂后发酵而制成。 酸牛奶一般使用嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亚乳杆菌两种菌的混合菌种作为纯培养发酵剂。酸牛奶中含有大量的活乳酸菌，一般每g中有106107个之多。有研究表明，这些乳酸菌对治疗肠道疾病有一定的疗效。,3、干酪（cheese）干酪是一种富含营养又容易消化吸收的食品。它是蛋白质、脂肪和钙、磷、硫的丰富来源，又有大量的维生素。 干酪是由
25、优质鲜乳经杀菌后，加入凝乳酶和微生物菌种，首先使乳液形成凝块，然后脱去乳清，再压块，发酵，逐渐“成熟”而成。制造干酪，现已很少进行自然发酵，目前都采用纯培养发酵剂来进行发酵成熟。发酵剂的制备与奶油发酵剂相同，多采用混合的乳酸菌，有的也采用丙酸菌和丝状菌。干酪在制造和成熟过程中，经历了复杂性的生物化学和微生物学的变化过程。,第十章微 生 物 的食品应用,蔬菜和水果的乳酸发酵食品,主要的乳酸发酵果蔬品种：泡菜、酸菜榨菜、冬菜、酸藏蘑菇、橄榄等。发酵方法：自然发酵、纯种发酵常用菌种：植物乳杆菌、黄瓜乳杆菌、短乳杆菌、肠膜明串珠菌、小片球菌、发酵乳杆菌等。亚硝酸问题,工业上的发酵是个广义的概念，它包括
26、所有利用微生物将一种物质转变为另外一些物质的过程。微生物利用基质，进行发酵，产生许多代谢产物，其中不少可供人类食用。 一、酒精发酵 （一）酒精发酵1、菌种用于酒精发酵的菌种一般是酵母菌。在生产上，以淀粉质为原料，进行酒精发酵的常用菌种有：,第五节 发酵酒类,（1）K氏酵母 是从日本引进的菌种。细胞呈卵圆形。该菌生长速度快，适合于糖度不超过19Bx的发酵。 （2）南阳1300 细胞多数呈椭圆形，比K氏酵母略大。适合于高浓度糖分发酵，能耐受13%的酒精。（3）南阳混合酵母（1308）细胞多数为圆形，该菌适合于在含有单宁物质的原料中进行发酵。这些酵母菌同属于一个种内的不同品系。通常是啤酒酵母。,多数
27、酒精酵母菌种的最适生长温度是2830，进行酒精发酵的最适温度是3033。最适pH值为4.55.5，但在pH值为3.54.0的条件下，还可生长繁殖。在40，酵母个体迅速衰老死亡。多数酵母菌对酒精的最大耐受量为12%左右。这些酵母菌体内有一个复杂的酶系统。借助于这个酶系统的作用，来完成发酵过程中一系列复杂的生物化学反应。比较重要的酶有：蔗糖转化酶、麦芽糖酶、酒化酶等酶类。,2、发酵机理以淀粉质为原料制造酒精的原理，首先是利用曲霉产生的大量糖化酶将淀粉和糊精转化为单糖。然后酒精酵母将利用单糖进行发酵，在无氧条件下，经过EMP途径，生成酒精和CO2。酒精发酵过程中不需要游离氧参加，因此是厌氧发酵，整个
28、过程是在密闭的发酵罐中进行。如果在发酵中有氧气参加，则酵母菌通过有氧呼吸获得能量，将糖彻底分解为CO2和水，同时产生大量的菌体，使酒精的产量大为减少，因此不宜开口发酵。,（1）制曲 发酵法生产酒精所使用的糖化剂，目前有三大类：固体曲、液体曲和酶制剂。生产糖化剂的菌种从前多采用东酒1号。自1979年以来，推广使用了新菌种黑曲霉AS.3.4309（即UY-11），使糖化剂的制造出现了一次飞跃。（2）酒母培养 用于酒精发酵中的酵母菌种子称酒母。培养基的糖浓度一般为1213Bx，另加0.05 %0.1%（NH4）2SO4。培养温度在2832左右，pH值维持在4.0左右。径过几次扩大，待酵母细胞数达到0
29、.5亿个/ml以上，出芽率30%，耗糖率在40%左右，无杂菌污染，即为成熟酒母。,（3）发酵 酒精发酵分为三个阶段：前发酵 开始发酵至610h，为前发酵时期。该期酵母迅速生产繁殖，但酒精和CO2的产生量较少，糖浓度下降慢，温度上升也慢，温度在3032左右。主发酵 主发酵时间一般在1224h之间。该期内升温猛，糖度下降快，发酵旺盛，酒精迅速积累，CO2大量放出。温度一般控制在36以内，否则酸度上升，影响出酒率。后发酵 后发酵历时40h之久。这时CO2生成量大大减少，糖浓度很低且下降缓慢。温度在30左右。,（二）饮料酒（beverage） 凡含有乙醇成分的饮料，都称为酒。由于原料、菌种、工艺和发酵
30、条件的不同，酒有很多种类，一般可分为啤酒、黄酒、果酒和白酒4类。1、啤酒（beer）啤酒是以麦芽、酒花为原料，经过麦芽糖化和酵母发酵而成的，含有低度酒精（一般含酒精35%左右）和CO2的饮料酒，营养价值很高，素有“液体面包”之称。,（1）菌种 制造啤酒，大多数采用啤酒酵母的各种菌株。啤酒酵母的细胞形态为圆形或卵圆形。幼年细胞较小，成熟时细胞较大。液体中培养的细胞往往大于在固体培养基中生长的细胞。啤酒酵母在麦芽汁琼脂培养基上生长，菌落表现出光滑、湿润、乳白色，边缘整齐的特征。在液体培养基中，呈混浊状态。上面啤酒酵母，悬浮于液面形成醭，而下面啤酒酵母则呈凝聚状，沉积于容器的底部。,从分类的角度来看
31、，上面啤酒酵母和下面啤酒酵母，是属于酵母属中的两个并列的种。 英国、新西兰等国家主要用上面啤酒酵母进行啤酒生产，欧洲则主要采用下面啤酒酵母进行啤酒生产。目前我国各啤酒厂大多数采 用下面啤酒酵母进行啤酒生产。 用梨形酵母（S. piriformis）和蠕形杆菌（Bacterium vermiforme）共同发酵可以制造姜汁啤酒（ginger beer）。,（2）发酵机理 啤酒发酵的机理和酒精发酵的机理一样，即麦芽经过糖化后，制成含麦芽糖、葡萄糖的麦芽汁。麦芽汁再经啤酒酵母进行发酵，形成啤酒。其主要生化反应仍是葡萄糖通过EMP途径，形成CO2和乙醇。不过，在啤酒发酵中，人们并不象对酒精发酵那样将主
32、要注意力集中在提高乙醇产量方面。相反地，却对乙醇以外的某些微量风味物质感兴趣。,（3）工艺流程 啤酒生产的工艺流程大致如下： 大麦 加工处理 生成麦芽 糖化 麦芽汁 过滤煮沸 添加酒花 冷却澄清 主发酵 后发酵 啤酒过滤 包装,制备麦芽 原料大麦经过处理以后，经过浸渍，吸收水分，在适当温度和足量的空气条件下，开始发芽。大麦在发芽过程中，内含物质发生变化，形成许多酶类。麦芽经干燥处理后，即为成品，可供糖化之用。 制造麦芽汁 成品麦芽经粉碎后，与温水混合，借助麦芽自身的多种水解酶（主要有 淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶等），将淀粉、蛋白质等高分子物质分解成可溶性低分子糖类、糊精、胨、肽、氨基酸等，这就
33、是糖化过程。糖化后的糖化醪经过滤、煮沸、添加酒花（hop）后，让其冷却澄清，即可供发酵用。,发酵 制备好的麦芽汁，加入酵母后，在适当条件下，开始发酵。发酵分为主发酵和后发酵两个阶段。主发酵阶段，根据发酵表面现象又可分为低泡、高泡和落泡三个期（有的分为四期、五期或六期）。后发酵也称啤酒的贮藏阶段。在贮藏期内，残糖继续进行发酵，饱充CO2，啤酒逐渐趋于成熟和澄清。成品啤酒 经过后发酵的成熟酒，其残余酵母和蛋白质凝固物沉淀于底部，少量悬浮于酒液中。经过滤后，即可得到透明的成品啤酒。,（4）啤酒生产中的有害微生物 在啤酒生产过程中，危害发酵和影响啤酒质量的微生物包括以下种类：野生酵母 凡是本厂培养的啤
34、酒酵母以外的其它酵母均称野生酵母。不少野生酵母引起生产障碍和影响啤酒质量。有的影响发酵，有的引起啤酒的混浊，有的则使啤酒产生讨厌的气味。常见的野生酵母种类有：巴氏酵母、葡萄酒酵母、啤酒酵母浑浊变种、 强壮酵母、魏氏酵母、啤酒醭酵母等。细菌污染 细菌污染时，常使啤酒发生混浊、发粘、变酸。主要种类 乳酸杆菌、醋酸菌及片球菌等。,2、黄酒(yellow wine, Shao-hsing rice wine)生产黄酒的菌种是根霉菌、曲霉菌和绍兴酵母的混和物。生产原料主要是糯米。 在酿造过程中，淀粉糖化、酒精发酵和陈酿（ageing）作用同时进行，所以糖液浓度不会过高积累。黄酒经酿成后，酒精含量约为15
35、20%，营养价值很高。,3、果酒（fruit wine）果酒是利用水果汁液经发酵而成的酒。酒精含量一般为916%。果酒中不仅含有果品中原有的营养成分（如维生素B1、B2、C等），而且还带有果品的独特风味，所以受到欢迎。在果酒产量中，葡萄酒占居首位。 进行葡萄酒生产的菌种主要是葡萄酒酵母（Saccharomyces cllisoideus）。生产原料是葡萄。葡萄经过处理后，接入菌种，即开始发酵。如果果皮与汁同时发酵，产品称为红葡萄酒；如果单独采用果汁发酵，就得到白葡萄酒。,4、白酒（distillate spirits） 白酒是用淀粉或含可发酵糖等物质为原料，经过发酵、蒸馏而制成的一种蒸馏酒。一
36、般用“大曲”中的微生物作为菌种。大曲是用小麦、大麦和豌豆为原料，经自然接种而制成的大砖块形的酒曲。由于是自然接种，曲中微生物复杂，但大曲中的特定成份是一种选择性培养基，因而决定了对酿酒起重要作用的微生物在曲中占优势。曲中主要是曲霉和酵母等。 白酒在发酵过程中除产生酒精外，还产生较多的酯类、高级酯类以及挥发性游离酸等物质，因而比其它酒更具香味。白酒中含酒精浓度一般在60%左右。,第十章微 生 物 的食品应用,食品添加剂中常见的氨基酸种类谷氨酸钠为鲜味剂、色氨酸和甘氨酸为甜味剂、赖氨酸为营养增强剂等生产用菌种谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等用于生产谷氨酸；北京棒杆菌的营养缺陷型菌株用于生产赖氨酸。常用原
37、料小麦、玉米、甘薯、大米等淀粉质物质；糖蜜等含糖丰富的物质。,第六节 氨基酸,谷氨酸过去是由水解法制得。自从1957年用微生物发酵糖类生产谷氨酸获得成功以来，发酵法就逐渐取代了水解法。味精是L-谷氨酸的钠盐，具有强烈的鲜味。（一）菌种能利用糖质发酵生产谷氨酸的微生物很多，但主要是一些细菌。例如棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属等。常用的菌种有：谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、双歧短杆菌等。在我国，目前生产上采用的菌种主要有：北京棒状杆菌AS.1.299、钝齿棒状杆菌AS.1.542、黄色短杆菌617和短杆菌T-613等。,一、谷氨酸发酵,（二）发酵机理以糖质为发酵原料时，谷氨酸的生物合成途径
38、包括糖的酵解（EMP）、已糖磷酸支路（HMP）、三羧酸循环（TCA）、乙醛酸循环、WoodWerkman反应（CO2的固定作用）等。 以黄色短杆菌为谷氨酸产生菌，谷氨酸的生物合成途径与上述大致相同。所不同的是，在以葡萄糖为碳源的培养基中，黄色短杆菌具有一定量的异柠檬酸酶。 （三）工艺流程 以糖质为原料，发酵生产谷氨酸的工艺流程,在谷氨酸生物合成过程中，生物素起着重要的作用。实验证明，当生物素缺乏时，L-谷氨酸的形成强烈受阻；但量太高时，也要阻碍L-谷氨酸的生物合成。只有在生物素限量下，才会大量分泌谷氨酸。许多适当浓度的农副产品，如玉米浆、甘蔗糖蜜等可用来代替生物素而加入到培养基中。,柠檬酸是一
39、种重要的化工原料，广泛用于食品、医药等工业。食品工业中，用量约占40%，常作为酸味剂加入饮料、果酱、糖果等食品中。医药工业中，用量约为30%，常作为调味剂用于糖浆、片剂。柠檬酸过去是从柑桔或菠萝中提取获得。自从1917年第一次报告由黑曲霉浅盘培养生产柠檬酸，特别是1938年首次发表深层培养论文以来，柠檬酸逐渐改用发酵法进行生产。,二、柠檬酸发酵,（一）菌种能产生柠檬酸的微生物很多，但以霉菌为主。例如，梨形毛霉、淡黄青霉、桔青霉、黑曲霉、棒曲霉、文氏曲霉、宇佐美曲霉、绿色木霉等。其中以黑曲霉和文氏曲霉产生柠檬酸的能力较强，并且能够利用多种碳源，因此常是生产上使用的菌种。但近年来，发现假丝酵母属中
40、一些种、某些细菌也能很好地生产柠檬酸。其中假丝酵母也已用于连续发酵。 我国目前所使用的菌种是黑曲霉Co827 。它是由上海工业微生物研究所选育成功的一支优良高产菌种，产酸率比原菌种大幅度提高。,（二）发酵机理关于由黑曲霉发酵生产柠檬酸的机理问题，已经积累了许多资料。虽然看法并非完全一致，但大多数学者都认为柠檬酸发酵与三羧酸循环是有着密切关系的。普遍相信，在黑曲霉细胞内即存在三羧酸循环，也存在着乙醛酸循环；乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶可被某些因素，例如金属离子的缺乏或代谢产物的存在，而受到抑制，这有利于柠檬酸的累积。目前一般认为，柠檬酸的形成是依下列途径进行的：葡萄糖经EMP途径变为丙酮酸。丙酮酸由
41、丙酮酸氧化酶氧化成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A。然后由于柠檬酸合成酶的作用，和草酰乙酸合成为柠檬酸。,（三）工艺流程在柠檬酸发酵中，下列因素有着重要的影响：（1）要使乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶缺失或尽量降低其活性，这样可以阻碍三羧酸循环的正常进行，从而增加了柠檬酸的累积。实践中可往培养基中加入亚铁氰化钾（要加得适时适量）或采取诱变手段改造菌种，来达到上述目的。（2）发酵液中的pH值对柠檬酸的生成影响很大，特别是用糖蜜原料进行发酵。在以黑曲霉为菌种，以糖质为原料，发酵生产柠檬酸的过程中，如果pH值在23时，则发酵产物主要是柠檬酸；如果pH值接近中性或碱性，则会产生较多的葡萄糖酸和草酸。,
