1、第九章 维生素类药物的分析,概 述,一、定义维生素是维持人体正常代谢功能所必需的微量生物活性物质，主要用于机体的能量转移和代谢调节，体内不能自行合成，必须从食物中摄取。,VitA、D2、D3、 E、K1 等,脂溶性,水溶性,VitB族 (B1、B2、B6、B12)VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺,VitM,VitPP,二、分类,三、分析方法 本类药物的分析方法很多，有生物法、微生物法、化学法和物理化学法，多依据其生物特性及理化性质进行，但目前常用的分析方法是化学法或物理化学法。,第一节 维生素A（Vitamin A）,维生素A包括有维生素A1（视黄醇）、去氢维生素A（维生素A2 ）和去水维生素A（
2、维生素A3）等，其中维生素A1活性最高，维生素A2的生物活性是维生素A1的30-40%，维生素A3的生物活性是维生素A1的0.4%，故通常所说的维生素A系指维生素A1。,-H 维生素A醇 -COCH3 维生素A醋酸酯 -COC15H31 维生素A棕榈酸酯,R :,一、结构和性质,1、为一个具有共轭多烯侧链的环己烯,（1）具有UV吸收,（2）存在多种立体异构化合物,（3）易发生脱氢、脱水、聚合反应,或有金属离子存在时更易氧化,2、不稳定性,3、与三氯化锑发生呈色反应,CHCl3,4、溶解性,不溶于水 易溶于有机溶剂和植物油等,1、三氯化锑反应,CHCl3,二、鉴别试验,维生素A在饱和无水三氯化锑
3、的无醇氯仿溶液中呈现不稳定的蓝色，再变为紫红色。,反应条件： 要求无水，如存在水可能产生氯化氧锑（ SbOCl ）。 配制所用的氯仿不能含醇（应用无醇氯仿）和光气（COCl2）。 三氯化锑有腐蚀性。,2、紫外吸收光谱维生素A分子中含有5个共轭双键，其无水乙醇液在326nm波长处有最大吸收。当在盐酸催化下加热，即发生脱水反应生成去水维生素A（A3）。去水维生素A比维生素A多一个共轭双键，其最大吸收波长向红移，在340390nm波长间出现3个最大吸收峰。 3、薄层色谱,三、含量测定,1、紫外分光光度法利用维生素A醇和其醋酸酯分子中具多烯共轭体系结构，在325328nm处有选择性吸收峰，故可进行含量
4、测定。,立体异构体 氧化产物及光照产物 合成中间体 去氢维生素A（ VitA2） 去水维生素A（ VitA3）,均对测定有干扰，故采用三点校正法,三点校正法 （1）条件： 杂质的吸收在310340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小； 物质对光的吸收具有加和性。,（2）波长的选择： 1 VitA的max（328nm） 2 3 分别在1的两侧各选一点,（3）测定方法： 第一法（直接测定法）,测定对象 VitA醋酸酯, 第二法（皂化法）：用醇制氢氧化钾加热皂化（水解），用乙醚提取，挥干溶剂，残渣用异丙醇溶解，测定含量。,测定对象 VitA醇,第一法 第二法 测定对象 维生素A醋酸酯
5、维生素A醇 方法 直接取样，测定 皂化提取，测定 溶剂 环己烷 异丙醇 max 328 nm 325 nm 测定波长 5个 4个 换算因数 1900 1830,第一法与第二法的区别,（二）三氯化锑比色法维生素A可与三氯化锑的氯仿溶液作用，产生蓝色，在618620nm波长处有最大吸收。可用于维生素A的比色测定。要求在510秒内测定。本法缺点多，已被UV法取代。 （三）高效液相色谱法,氨基嘧啶环CH2噻唑环(季铵碱),HCl,Cl-,维生素B1（盐酸硫胺）,第二节 维生素B1的分析,（1）溶解性,易溶于水,水溶液呈酸性,（2）UV共轭双键,max = 246nm,（一）结构与性质,嘧啶环 伯氨,噻
6、唑环 季铵,1、可与酸成盐,2、与生物碱,3、含量测定 非水碱量法,（3）,硫色素反应,（4）,碱性,（二）鉴别试验,1、硫色素反应（VitB1的专属反应）,VitB1,H+,H+,H+,H+,2、沉淀反应,1、非水溶液滴定法（药典用于测定原料药）原理：利用噻唑环上季铵和嘧啶环上氨基的弱碱性，在非水溶液中用高氯酸液滴定。,（三）含量测定,2、UV分光光度法（药典用于测定片剂、注射剂） （1）原理：维生素B1分子中具有共轭双键结构，具有紫外吸收特征，可在其最大吸收波长下测定吸收度，根据取样量计算含量。 （2）方法,NaOH,（三）硫色素荧光法,激发波长365nm 发射波长435nm,（2）方法与
7、计算,+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇,+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇,S,d,A,b,对照液,供试液,（3）特点,灵敏度高，线性范围宽 代谢产物不干扰，适用于体液分析,L抗坏血酸,第三节 维生素C的分析,(一）结构与性质,1、溶解性,C3OH的 pKa = 4.17,C2OH的 pKa = 11.57,2、酸性,一元酸,二烯醇结构,二酮基结构,二烯醇结构,3、强还原性,L(+)抗坏血酸 活性最强,手性C（C4、C5）,4、光学活性,糖类的显色反应,50,结构与糖类相似,5、具糖的性质,6、UV特征,（二）鉴别试验,1、与AgN
8、O3反应,2、与2，6 - 二氯靛酚反应,(ChP2000),氧化型,玫瑰红色,(ChP2000),3、与碱性酒石酸铜反应,USP,4、与KMnO4反应,5、糖类的反应,6、紫外分光光度法,（三）杂质检查（略） 1、溶液的澄清度与颜色检查 2、铁、铜离子的检查：原子吸收分光光度,指示剂 淀粉指示液,1、碘量法,（四）含量测定,取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6,（2）方法, 酸性环境 d . H
9、Cl, 新沸冷H2O,减慢VitC被O2氧化速度,（3）讨论, 立即滴定,减免水中O2的干扰,减少O2的干扰,（二）2，6 - 二氯靛酚钠滴定法,USP,JP,（2）方法,快速滴定 2min内,酸性环境 HPO3-HAc,稳定VitC,防止其他还原性物质干扰,剩余比色测定,（定量过量）,（测剩余染料）,（3）讨论,（4）缺点,需经常标定,贮存一周,干扰多 氧化力较强,（三）高效液相色谱法,维生素D是一类抗佝偻病维生素的总称。目前已知的维生素D类物质至少有十种之多，它们都是甾醇的衍生物。中国药典主要收载有维生素D2、D3原料药；维生素D2胶丸和注射剂；维生素D，注射剂。USP(24)收载有片剂、
10、胶囊、口服液等剂型。BP(2000)收载的剂型有片剂、口服液、注射液以及钙与维生素D2、D3制成的复方片剂。,第四节 维生素D的分析,(一)结构维生素D2为9，10-开环麦角甾5，7，10(19)，22-四烯3-醇，又名骨化醇或麦角骨化醇。维生素D3为9，10-开环胆甾-5，7，10(19)三烯-3-醇，又名胆骨化醇。两者的化学结构十分相似，其差别仅是维生素D2比维生素D3在侧链上多一个双键，C24上多一个甲基。,一、结构与性质,VD2,VD3,(二)性质1、性状 维生素D2、D3均为无色针状结晶或白色结晶性粉末；无臭，无味；遇光或空气均易变质。 2、溶解性 维生素D2在氯仿中极易溶解，在乙醇
11、、丙酮或乙醚中易溶；维生素D3在乙醇、丙酮、氯仿或乙醚中极易溶解；二者均在植物油中略溶，在水中不溶。3、不稳定性 维生素D2、D3因含有多个烯键，所以极不稳定，遇光或空气及其他氧化剂均发生氧化而变质，使效价降低，毒性增强。本品对酸也不稳定。4、旋光性 维生素D2具有6个手性碳原子，而维生素D3有5个手性碳原子，所以二者均具有旋光性。,5、显色反应 本品的氯仿溶液，加醋酐与硫酸，初显黄色，渐变红色，迅即变为紫色，最后变为绿色。本反应为甾类化合物的共有反应。 6紫外吸收特性 取本品，加无水乙醇溶解并定量稀释制成每10ml中约含10ug的溶液。照分光光度法，在265nm的波长处测定吸收度，维生素D2
12、的吸收系数为460-490；维生素D3的吸收系数为465-495。,(一)显色反应1、与醋酐浓硫酸反应 取维生素D2或D3约0.5mg，加氯仿5m1溶解后，加醋酐0.3ml与硫酸0.1ml，振摇，维生素D2初显黄色，渐变红色，迅即变为紫色，最后成绿色。维生素D3初显黄色，渐变红色，迅即变为紫色、蓝绿色，最后变为绿色。2、与三氯化锑反应 取本品适量(约1000单位)，加1，2-二氯乙烷1m1溶解，加三氯化锑试液4ml，溶液即显橙红色，逐渐变为粉红色。3、其它显色反应 维生素D与三氯化铁反应呈橙黄色，与二氯丙醇和乙酰氯试剂反应显绿色，均可用于鉴别，但专属性不强。,二、鉴别试验,(二)比旋度鉴别取维
13、生素D2，精密称定，加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1m1中含40mg的溶液，依法测定，比旋度为+102.5。至+107.5。；维生素D3加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1ml中含5mg的溶液，依法测定，比旋度为十105。至+112。(二者均应于容器开启后30min内取样，并在溶液配制后30min内测定)。(三)其他鉴别方法维生素D2、D3可用薄层色谱法、HPLC法和制备衍生物测熔点进行鉴别。此外，亦可通过其紫外、红外吸收光谱的特征加以鉴别。,(四)维生素D2、D3的区别反应取维生素D10mg，溶于96乙醇10ml中。取此液0.1m1，加乙醇1ml和85硫酸5ml。维生素D2显红色，在570nm波
14、长处有最大吸收；维生素D3显黄色，在495nm波长处有最大吸收。此反应也用于D2和D3的含量测定。,(一)麦角甾醇的检查 (二)前维生素D的光照产物,三、杂质检查（略）,(一)维生素D测定法 （二）讨论,四、含量测定（略）,维生素D的含量测定方法各国药典各异。USP(24)关于维生素D的测定方法有化学法、色谱法和微生物法；BP(2000)有化学法、光谱法和色谱法；而中国药典采用正相高效液相色谱法测定。,维生素E（消旋-生育酚醋酸酯）,苯并二氢吡喃醇,第五节 维生素E的分析,*,*,*,生物效价右旋体 ： 消旋体 = 1.4 ：10,（天然品）,（合成品）,dl生育酚醋酸酯,（一）结构与性质,苯
15、环 + 二氢吡喃环 + 饱和烃链,1、易溶于有机溶剂，不溶于水,2、UV,3、酯键 易水解,1、硝酸反应,（二）鉴别,2、三氯化铁联吡啶反应,3、紫外光谱法 4、薄层色谱法 5、其他方法,（三）杂质检查 1、酸度 2、生育酚,硫酸铈滴定液（0.01mol/L） 二苯胺（亮黄灰紫）,（1）原理：利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈,（2）试剂,（四）含量测定,1、GC法,（1） GC特点,选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好,挥发性低、不稳定、极性强衍生化易受样品蒸气压限制,本 章 小 结 1、VitA：掌握三氯化锑鉴别反应的原理、 UV法含量测定的原理及两种测定方法的区别。 3、 VitB1：掌握硫色素反应（鉴别及含量测定）的原理。,3、 VitC：掌握其结构特征（还原性）、碘量法含量测定的原理及操作注意事项。 4、VitE：掌握硝酸反应的原理。,
