1、第六章 酶工程制药,第一节 概 述 第二节 酶和细胞的固定化 第三节 固定化酶和固定化细胞的反应器 第四节 酶工程研究的展望,第六章 酶工程制药,一、酶工程简介 二、酶的来源 三、酶的生产菌四、酶在医药领域的应用,酶工程（enzyme engineering）的概念：是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术科学，它是从应用的目的出发研究酶，应用酶的特异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。,2. 酶工程主要研究内容：（1） 酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的应用开发； （2）酶和细胞的固定化及酶反应器的研究（包括酶传感器、反应检测等）；（3）酶生产中基因工程技术的应用及
2、遗传修饰酶（突变酶）的研究； （4）酶的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关系的研究； （5）有机相中酶反应的研究； （6）酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究； （7）抗体酶、核酸酶的研究； （8）模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。酶工程技术和应用研究在工业、农业、医药和食品等方面发挥着极其重 要的作用。,直接从生物体抽提分离（动物、植物、微生物）动物组织提供的酶主要有胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪的凝乳酶等。植物提供的酶主要有蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。动植物原料的生长周期长、来源有限，又受地理、气候和季节等因素的影响，不适于大规模生产。近10多年来，动植物组织和细胞培养技术取
3、得了很大的进步，但因其周期长、成本高，因而还有一系列问题正待解决。目前工业生产一般都以微生物为主要来源，目前在千余种被使用的商品酶中，大多数都是利用微生物生产的。人工合成,利用微生物生产酶制剂的优点：（1）微生物种类繁多，酶的品种齐全，可以说一切动植物体内存在 的酶几乎都能从微生物中得到。（2）微生物繁殖快、生产周期短、产量高。（3）培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高，并可以通过控制培养条件来提高酶的产量。（4）微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过各种遗传变异的手段，培育出新的高产菌株。,1酶的发酵技术：有目的地利用微生物生产酶的方法称为酶的发酵技术。2. 作为酶制剂的生产
4、菌应具备以下几点要求：（1）繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而且最好是产生胞外酶的菌；（2）不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要；（3）产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；（4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。,3生产菌的来源 （1）菌种保藏机构和有关研究部门； （2）从自然界中分离筛选。自然界是产酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。筛选产酶菌的方法主要包括以下几个步骤：菌样采集、菌种的分离初筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。为了提高酶的产量，在酶的生产过程中应不断改良生产菌。主要应用遗传学原
5、理进行改良，其基本途径有：基因突变、基因转移和基因克隆。,5目前常用的产酶微生物：大肠杆菌（Ecoli）用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、半乳糖苷酶等。枯草杆菌主要用于生产淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶酵母主要用于生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶等。曲霉（黑曲霉和黄曲霉）可用于生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶等。青霉主要用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、5磷酸二酯酶、脂肪酶等的；根霉主要用于生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶木霉主要用于生产纤维素酶链霉菌主要用于生产葡萄糖异构酶等,1.在疾病诊断方面的应用酶学诊断方法可靠、简便、快捷，在临
6、床诊断中已被广泛使用。酶学诊断包括两个方面：一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，如利用谷丙转氨酶活力升高来诊断肝炎；二是用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病，如利用葡萄糖氧化酶测定血糖含量，诊断糖尿病等。,2.在疾病治疗方面的应用由于酶具有专一性和高效率的特点，所以在医药方面使用的酶具有种类多、用量少和纯度高等特点。主要的医药用酶有：（1）蛋白酶主要用于消化不良和食欲不振等。（2）溶菌酶具有抗菌、消炎、镇痛等作用。（3）超氧化物歧化酶，具有抗辐射作用。（4）L-天冬酰胺酶用于治疗白血病。（5）尿激酶具有溶血栓的活性。（6）其他相关酶制剂，如细胞色素C等。,3.在药物生产方面的应用酶在药物
7、制造方面的应用是利用酶的催化作用将前体物质转为 药物。主要的应用有：（1）利用青霉素酰化酶制造半合成青霉素和头孢霉素；（2）利用-酪氨酸酶制造多巴（3）利用核苷磷酸化酶生产阿糖腺苷（4）利用蛋白酶和羧肽酶将猪胰岛素转化为人胰岛素等。,4. 在分析检测方面的应用用酶进行物质分析检测的方法统称为酶法检测或酶法分析。酶法检测可以分为单酶反应、多酶偶联反应和酶标免疫反应等三类。,一、固定化酶的制备二、固定化细胞的制备 三、固定化方法与载体的选择依据 四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质,1固定化酶的定义：固定化酶（immobilized enzyme）是指限制或固定于特定空间位置 的酶，具体来说，是指
8、经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失 即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程 称为酶的固定化。,2固定化酶的特点：固定化酶的最大特点是既具有生物催化剂的功能，又具有固相催化剂的特性。与天然酶相比，固定化酶具有下列优点：（1）酶的稳定性提高。（2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高。（3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续和自动控制。（4）酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少。（5）比水溶性酶更适合于多酶反应。,固定化酶的缺点：（1）固定化时，酶活力有损失。 （2）增加了生产的成本，工厂初始投资大。 （3）只能用于
9、可溶性底物，而且较适于小分子底物，对大分子底物不适宜。（4）胞内酶必须经过酶的分离纯化过程。 （5）与完整菌体相比不适宜用于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。,3酶的固定化方法与制备技术：按所用的载体和操作方法的差异，一般可分为：（1）载体结合法（2）包埋法（3）交联法,（1）载体结合法 载体结合法是将酶结合于不溶性载体上的种固定化方法。根据结合形式的不同，可分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法等三种。,（2）交联法交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺2,2二磺酸、1,5二氟2,4二硝基苯及己二酰亚胺二甲酯等。 交
10、联法又可分为交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法及载体交联法4种。,（3）包埋法 包埋法可分为网格型和微囊型两种。将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型；将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。,4酶和细胞的固定化载体在酶的固定化过程中所用的水不溶性固体支持物称为载体或基质。固定化载体种类很多，其来源、结构和性质各不相同。因此在固定化 过程中，需根据酶促反应性质、底物类型及固定化方法，选择相应的载体或基质。,固定化过程中使用的载体需符合如下条件：（1） 固定化过程中不引起酶变性；（2） 对酸碱有一定的耐受性；（3）有一定的机械强度；（4） 有定的亲水性及良好的稳定性；（5）有
11、一定的疏松网状结构，颗粒均匀；（6）共价结合时具有可活化基团；（7） 有耐受酶和微生物细胞的能力；（8） 廉价易得。,酶和细胞的固定化载体主要有以下3类：（1）吸附载体 ： 用于吸附法制备固定化酶，有物理吸附和离子吸附。物理吸附所用的载体有无机物和有机物。（2）包埋载体： 工业上应用的包埋载体主要为卡拉胶、海藻胶等。（3）交联载体： 交联法与吸附法和包埋法所用的载体相同。,固定化细胞的定义将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与固定化酶一起被称为固定化生物催化剂。固定化细胞主要是利用细胞内酶和酶系，它的实际应用比固定化酶更为普
12、遍。细胞固定化技术的应用比固定化酶更为普遍，已在医药、食品、化工、医疗诊断、农业、分析、环保、能源开发及理论研究的应用中取得了举世瞩日的成就。,2. 固定化细胞的特点固定化细胞既有细胞特性，也有生物催化剂功能，又具有固相催化剂待点。其优点在于：（1）无需进行酶的分离纯化。（2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高。（3）细胞内酶比固定化酶稳定性更高。（4）细胞内酶的辅因子可以自动再生。（5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应。（6）抗污染能力强。,2. 固定化细胞的特点固定化技术的局限性：（1）利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物 （2）细胞膜、细胞壁和载体
13、都存在着扩散限制作用。（3）载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性。,3. 固定化细胞的制备技术细胞的固定化技术是酶的固定化技术的延伸，其制备方法和应用方法也 基本相同，但细胞的固定比主要适用于胞内酶，要求底物和产物容易透过细 胞膜，细胞内不存在产物分解系统及其他副反应；若存在副反应，应具有相 应的消除措施。固定化细胞的制备方法有载体结合法、包埋法、交联法及无载体法等。,1固定化方法的选择应考虑下述几个因素来选择固定化的方法：（1）固定化酶应用的安全性 （2）固定化酶在操作中的稳定性 （3）固定化的成本,2载体的选择最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体， 如聚乙烯醇、卡拉胶及海藻胶
14、等。另外离子交换树脂、金属 氧化物及不锈钢碎屑等，也都是有应用前途的载体。,载体的选择还应考虑底物的性质。固定化方法具有多样性。,1固定化酶与固定化细胞的形状已有多种物理形状的固定化酶，如酶膜、酶管、酶纤维、微囊和颗粒状的固定化酶。颗粒状的固定化酶包括酶珠、酶块、酶片和酶粉等。制造何种形状的固定化酶，需要根据底物和产物的性质、基质材料的性能、固定化的方法、酶反应的性质、反应器的类型和应用目的来决定。,（1）颗粒状固定化酶 颗粒状的固定化酶包括酶珠、酶块、酶片和酶粉等。每种固定化方法均可制备颗粒状的固定化酶，制备方法简单，颗粒比表面积大，转化效率高，适用于各种类型的反应器。如海藻胶溶液和酿酒酵母
15、的混合液经喷珠机压入到CaCl2溶液中即可制成固定化的酵母酶珠，可用于工业化中乙醇的大规模生产。,（2）纤维状固定化酶 某些材料，如三醋酸纤维素，用适当的溶剂溶解后与酶混合，再采用喷丝的方法就可制成酶纤维。如将含酶的甘油水溶液滴入三醋酸纤维素的二氯甲烷溶液中，乳化后经喷丝头喷入含丙酮的凝固液中即成为纤维状，取出后真空干燥即得固定化酶。纤维状固定化的的比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。酶纤维也可以织成酶布用于填充床反应器。,（3）膜状固定化酶 膜状固定化酶也称为酶膜，可以通过共价结合法将酶偶联到滤膜上制备，也可以将酶和某些材料如火棉胶、硝酸纤维素、骨胶原和明胶等，用戊二醛交联或其他
16、方法处理后制成膜状。酶膜的表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床反应器。目前已制备出木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、氨基酰化酶和脲酶等多种酶膜。,（4）管状固定化酶 管状固定化酶称为酶管，某些管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺等，经活化后与酶偶联即得固定化酶管。目前已制备出糖化酶、转化酶和脲酶等酶管，酶管在化学分析中可用于连续测定。酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也可以组装成列管式反应器。,细胞的固定化技术是酶的固定化技术的延伸，制备方法也基本相同，因此许多固定化细胞的形状与固定化酶的形状相同，如珠状、块状、片状或纤维状等。固定化细胞的方法主要是包埋法，其次
17、是交联法或二者相结合的方法，用无载体法制备的是粉末状的固定化细胞，工业上应用最多的就是用包埋法制备的各种形状的固定化细胞。,2固定化酶的性质天然酶经过固定化后即成为固定化酶，其催化反应体系也 由均相反应转变为非均相反应。由于固定化的方法和所用的载 体不同，制得的固定化酶可能会受到扩散限制、空间障碍、微 环境变化和化学修饰等因素的影响，可能会导致酶学性质和酶 活力的变化。,3固定化细胞的性质细胞被固定化后，其中酶的性质、稳定性、最适pH、最适温度和Km值的变化基本上与固定化酶相仿。细胞的固定化主要是利用胞内酶，因此固定化的细胞主要用于催化小分子底物的反应，而不适于大分子底物。无论采用哪种固定化方
18、法，都需采用适当的措施来提高细胞膜的通透性，以提高酶的活力和转化效率。,1.固定化酶（细胞）活力的测定2.偶联率及相对活力的测定,一、反应器的类型和特点二、反应器的选择依据,可概括分为间歇式和连续式两大类，后者又有两种基本形式：连续流动搅拌罐式反应器和填充床反应器；还有一些衍生形式，如连续流动搅拌罐超滤膜反应器、循环反应器和流化床反应器等。,目前虽有多种不同类型的反应器可供使用，但是并没有一种通用的理想的反应器，在研究和生产中，必须根据具体情况来选样合适的反应器。影响反应器选择的因素很多，但一般从以下几方面考虑：1根据固定化酶的形状来选择 2根据底物的物理性质来选择3根据酶反应的动力学特性来选
19、择4根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择5根据操作要求及反应器费用来选择,一、酶的化学修饰 二、酶的人工模拟三、有机相的酶反应四、基因工程酶的构建,酶化学修饰的概念从广义上说，凡涉及共价键或部分共价键的形成或破坏的转变 都可看做是酶的化学修饰。从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件下，以可控 制的方式使一种酶同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基 酸残基或其功能基团发生共价的化学改变。,2. 酶化学修饰的目的酶化学修饰的目的在于：人为地改变天然酶的一些性质，创造 天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，来扩大酶的 应用领域，促进生物技术的发展。酶经过改造后会产生各种各样的变化
20、，概括起来主要有：（1）提高生物活性。（2）增强在不良环境（非生理条件）中的稳定性。（3）针对异体反应，降低生物识别能力。可以说，酶的化学修饰在理论上为生物大分子结构与功能关系 的研究提供了有力的实验依据和证明，是改善酶学性质和提高其应用价值的一种非常有效的措施。,3. 酶化学修饰的方法（1）酶的表面化学修饰大分子修饰可溶性大分子，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙 烯酸(PAA )、聚氨基酸、葡聚糖、环糊精、乙烯顺丁烯二酰肼共聚物、羧甲基纤维素、多聚唾液酸、肝素等可通过共价键连接在酶分子表面，形成覆盖层。相对分子质量在50020000范围内的PEG类修饰剂应用最广，它是既能
21、溶于水，又可以溶于绝大多数有机溶剂的两亲分子，一般没有免疫原性 和毒性，其生物相容性已经通过美国FDA认证。,（1）酶的表面化学修饰小分子修饰：利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶学性质。已被广泛应用的小分子化合物主要有氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、邻苯二酸酐、乙酸一N一丁二酰亚胺酯等。,（1）酶的表面化学修饰交联修饰应用双功能基团试剂如戊二醛、PEG等将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联，可使酶分子活性结构加固，并 可提高其稳定性，增加了酶在非水溶液中的使用价值。固定化修饰,（2）酶分子内部修饰非催化活性基团的修饰最常修饰的残基既
22、可以是亲核的，如Ser、Cys、Met、Thr、Lys、 His；也可以是亲电的，如Tyr、Trp；或者是可氧化的，如Tyr、Trp、Met 。对这类非催化残基的修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。,（2）酶分子内部修饰蛋白主链的修饰蛋白主链修饰主要靠酶法。将猪胰岛素转变成人胰岛素就是一个成功的例子。猪和人的胰岛素仅 在链羧基端有一个氨基酸的差别。用蛋白水解酶将猪胰岛素链末端的Ala水解下来，再在一定条件下，用同一个酶将Thr接上去，就可以将猪胰 岛素转变成人胰岛素。,（2）酶分子内部修饰催化活性基团的修饰选择性修饰氨基酸侧链。,（2）酶分子内部修饰 与辅因子有关的修饰：包括
23、以下几个方面A. 依赖辅因子的酶可用两种方法进行化学修饰。第一，如果辅因子与酶的结合不是共价的，则可将辅因子共价结合在酶上；第二，引入新的或修饰过具有强反应性的辅因子。B. 将新的辅酶引入结构已经弄清的蛋白质上。C. 金属酶中的金属取代。酶分子中的金属取代可以改变酶的专一性、稳定性及其抑制作用。,（2）酶分子内部修饰 肽链伸展后的修饰为了有效地修饰酶分子的内部区域，可以先用脲或盐酸胍处理酶，使酶分子的肽链充分伸展，这就提供了化学修饰酶分子内部疏水基团的可能性。然后，让修饰后的伸展肽链，在适当条件下，重新折叠成具有某种催化活力的构象。,（3）结合定点突变的化学修饰通过一些可控制的方法在酶或蛋白质
24、特殊的位点引入特定分子来修饰酶或蛋白质，结合定点突变引入一种非天然氨基酸侧链来进行化学修饰，从而得到一些新颖的酶制剂。它的策略是利用定点突变技术在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰法将突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化合物，得到一种称为化学修饰突变酶(chemically modifiedmutant enzyme, CMM)的新型酶。,4. 修饰酶的特性酶分子经过化学修饰后，其特性在一定程度上发生了改变，天然酶的一些不足之处可以得到改善。（1）热稳定性提高；（2）抗各类失活因子能力提高；（3）抗原性消除；（4）体内半衰期延长；（5）最适pH改变；（6）酶学性质变化；
25、（7）对组织分布能力改变。,酶化学修饰的应用及其局限性（1）酶化学修饰的应用酶结构与功能的研究在医药方面的应用在工业方面的应用,（2）酶化学修饰的局限性 某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少 有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。因为同一种氨基酸残基在不同酶分子中所存在的状态不同，所以同一种修饰剂对不同酶的修饰行为也不同。 化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。 酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，其他氨 基酸侧链在维持酶的空间构象方面也有重要作用。 酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一
26、氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所必需的。化学修饰法研究酶结构与功能关系还缺乏准确性和系统性。,1. 模拟酶的概念人工模拟酶指根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶 性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。它们一般具有高效和高适应性的特点，在结构上比天然酶相对简单。,2. 模拟酶的分类根据Kirby分类法，模拟酶可分为：（1）单纯酶模型，即以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性。（2）机制酶模型，即通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和生产。（3）单纯合成的酶样化合物，即一些化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。,2. 模拟酶的
27、分类按照模拟酶的属性可分为：（1）主一客体酶，包括环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟 啉类等。（2）胶束酶。（3）肽酶。（4）半合成酶。（5）分子印迹酶等。,3. 人工模拟酶的研究意义及展望（1）人工模拟酶的研究是生物有机化学的重要研究领域之一。（2）人工模拟酶的研究，是实现人工合成具有高性能模拟酶的基础， 在理论和实际应用中都具有重要意义。（3）人工模拟酶的研究属于化学、生物学等领域的交叉点，属于交叉学科。,有机相酶反应的特点：有机相酶反应是指酶在具有有机溶剂存在的介质中所进行的催化反应。 有机相中酶催化反应除了具有酶在水中所具有的特点外，还具有其独特的优点：（1）增加疏水性底物或产物的
28、溶解度。（2）热力学平衡向合成方向移动，如酯合成、肽合成等。（3）可抑制有水参与的副反应，如酸酐的水解等。（4）酶不溶于有机介质，易于回收再利用。（5）容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物。（6）酶的热稳定性提高，pH的适应性扩大。（7）无微生物污染。（8）能测定某些在水介质中不能测定的常数。（9）固定化酶方法简单，可以只沉积在载体表面。,有机相酶反应发展较快，目前发现在有机相中酶催化反应的类型有氧化还原、酯合成、酯交换、脱氧、酰胺化、甲基化、羟化、磷酸化、脱氨、异构化、环氧化、开环聚合、侧链切除、缩合（聚合）及卤代等，这些都具有重要的研究意义和应用价值。例如，利用脂肪酶催化不对称合成反应，制备具有光学活性的醇、脂肪酸及其酯、内酯等医药、农药和人体代谢过程的中间体；利用脂肪酶的催化合成和酯交换等反应，可以合成抗生素和香料等大环内酯，改良油脂，合成有医用价值的糖脂、固醇脂和多肽等。有机相酶反应的应用范围将会越来越广。,基因工程技术的问世，对酶学起到了巨大的推动和变革作用。基因工程酶是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学相结合的产物。基因工程酶的构建主要包括3个方面：（1）酶基因的克隆和表达，用基因工程菌大量生产酶； （2）修饰酶基因和产生遗传修饰酶（突变酶）；（3）酶的遗传设计，合成自然界没有的新酶。,
