1、第七章 工业发酵染菌的防治,本章内容简介,染菌的危害 染菌的发现 染菌的分析 染菌的预防 染菌后的挽救,1 染菌的危害,浪费原材料，造成巨大经济损失扰乱生产秩序，破坏生产计划影响人们的情绪和生产积极性影响产品外观及内在质量,1.1 染菌对发酵的影响,生产菌种 污染微生物的种类和性质、污染菌量 污染时间，污染途径 培养基，培养条件,感染不同种类和性质杂菌对发酵的影响不同,染菌对不同产品的影响不同,不同染菌时间对发酵的影响不同,染菌危害,一、染菌对不同产品的影响 青霉素：产量降低； 疫苗：全部废弃。 柠檬酸：前期染菌严重； 氨基酸：噬菌体污染常发生； 核苷酸：易染菌（生产菌常为缺陷型，生长慢）；
2、链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素：程度不同地降低产量。 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素：抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。,二、不同种类和性质的杂菌对发酵的影响污染噬菌体噬菌体的感染力强，传播蔓延迅速，也较防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产。,污染其它杂菌有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。芽孢杆菌耐热，不易杀死。,不同发酵对杂菌感染的敏感性不同。 (1)青霉素和链霉素：细短杆菌的危害大于粗大杆菌； (2)四环素：对双球菌、芽孢
3、杆菌和荚膜杆菌污染敏感； (3)柠檬酸：对青霉菌敏感； (4)核苷酸：对芽孢杆菌敏感 (5)氨基酸：对噬菌体敏感；,三、不同染菌时间对发酵的影响污染时间：无菌检测方法测出的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。 (1)种子染菌：影响最大； (2)前期：灭菌后重新接种； (3)中期：对生产影响大； (4)后期：一般不严重，若严重时可放罐；,1.4 发酵染菌对提炼和产品质量的影响,1）发酵染菌对过滤的影响,粘度大 过滤困难 拉长过滤时间，影响设备周转 降低过滤收率 影响程度：杂菌种类，污染程度 措施：加热、冷却、添加助滤剂等,2） 发酵染菌对提炼的影响,沉淀法：杂质污染产物有机溶剂萃取：乳化，难分离
4、。离子交换：降低离子交换树脂的交换容量，杂菌难冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液。,2 染菌的表现,种子： 生长缓慢 菌丝结团 代谢异常,发酵： 菌体生长差 pH异常 溶氧异常 泡沫过多 菌体浓度异常,3 染菌的分析,总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内。总染菌率%=,染菌原因：种子、无菌空气、设备渗漏、灭菌不彻底、操作不当、管理不善等。 染菌时间 早期：种、气、设备、灭菌不彻底、操作不当； 后期：补料不当、渗漏。,染菌种类 耐热芽孢杆菌：灭菌不彻底； 球菌或无芽孢杆菌：种、渗漏； 浅绿色杂菌：冷水管渗漏； 霉菌
5、：灭菌不彻底或操作问题； 染菌幅度 各个或数个发酵罐感染相同杂菌：空气系统； 个别罐连续感染杂菌：设备问题；,日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析项目 百分率% 种子带菌或怀疑种子带菌 9.64 接种时罐压跌零 0.19 培养基灭菌不透 0.79 总空气系统有菌 19.96 泡沫冒顶 0.48 夹套穿孔 12.36 盘管穿孔 5.89 接种管穿孔 0.39 阀门渗漏 1.45 搅拌轴密封渗漏 2.09 罐盖漏 1.54 其它设备渗漏 10.13 操作原因 10.15 原因不明 24.94,上海第三制药厂染菌原因分析项目 百分率% 种子带菌 14.15 盘管穿孔 14.20 阀门
6、渗漏 23.30 空气系统有菌 10.0 管理不善 25.80 其它 7.49 原因不明 5.78,管理不善而染菌的有31个罐批，占25.08经分析有下表所列原因： 项目 百分率% 进罐前未做设备严密度检查 25.8 接种违反操作规程 25.8 检修质量缺乏验收制度 19.35 操作不熟练 19.35 配料违反工艺规程 6.45 调度不当 3.25,第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析项目 百分率% 外界带入杂菌（取样、补料） 8.20 设备穿孔 7.60 空气系统有菌 26.00 停电罐压跌零 1.60 接种 11.00 蒸汽压力不足或蒸汽量不足 0.60 管理问题 7.80 操作违反规程 1.
7、60 种子带菌 0.60 原因不明 35.00,染菌的原因有多种，对于实际情况如何分析呢？ 单罐染菌 不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤器失效 多罐染菌 系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是总过滤器长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底,前期染菌 种子带菌、培养基灭菌不彻底中后期染菌 补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗漏，一般不会是种子问题,检查与判断 表观法： 溶氧水平 排气中CO2 实验法： 镜检法 平皿划线或斜面检查法 肉汤培养法,1）防止种子带菌,4 染菌的预防,种子带菌的原因 灭菌不彻底(如假压)； 移种污
8、染； 养或保藏过程中污染； 无菌室管理不善；,制备壮、纯、量足的种子是发酵成功的关键，为此：强化无菌室的管理(使用前灭菌)；严格接种、移种的无菌操作；在扩培各阶段定时取样做无菌实验；严格接种管灭菌，并用无菌空气保压；,无菌状况的检测,环境无菌的检查 尘埃粒子检测 无菌平板检测,无菌室要求,打开紫外灯，照半小时，关灯后15分钟再接种。消毒药水擦桌子、拖地，开启超净台的通风，接种时必须在超净台上操作，保证无菌条件。接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干净。,种子及发酵液无菌状况检测,梭状芽孢杆菌,双球菌,2）防止空气引起的染菌 流程或设备设计的合理性； 过虑介质选用、装填； 过虑介质的
9、灭菌和管理； 从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气带菌而造成的染菌分别为19.96和 26%。空气除菌系统复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。,空气过滤除菌设备流程,空压机,储罐,二级冷却,加热器,空气过滤,粗过滤,空气冷却器的列管穿孔泄露，冷却水会渗入到空气中，造成染菌。 棉花-活性炭过滤器长期使用后变薄的一边失效。 过滤介质受潮失效：过滤器灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气，将水分吹干。超细纤维纸作过滤介质，灭菌时必须将管道中冷凝水放干净，以免介质受潮失效。在生产实践中，空气管道大多与其它物料管道相接，要装上止逆阀防止其它物料窜入空气管道污染过滤器，导致过滤介质失效。,3）防止培养
10、基灭菌不彻底,培养基灭菌方法高压蒸汽灭菌 分批灭菌 121，30分钟 连续灭菌 罐温125130 ，3045分钟,空气净化系统,连续灭菌设备流程,连 消 塔,灭菌技术好坏与灭菌质量相关 蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间产生过多泡沫 蒸汽总压是否达到要求标准 杂菌数量：季节、原材料储存和保管 设备的清洗质量、有无灭菌的死角,为什么蒸汽灭菌时会产生大量泡沫呢？培养基和水的传热系数比空气的传热系数大，如果灭菌时升温太快，培养基急剧膨胀，发酵罐内的空气排出较慢，就会产生大量泡沫，泡沫上升到发酵罐顶，泡沫中的耐热菌就不能与蒸汽直接接触，未被杀死。防止方法：缓慢开启蒸汽阀门，或加入消泡剂,培养基灭菌不彻
11、底原因 蒸气压力或蒸气量不足、灭菌时间不够； 灭菌时培养基产泡沫或罐内有污垢堆积、或基质中有不溶解的固体颗粒； 蒸汽短路 (1)原料性状： (2)假压的形成； (3)参数不稳定（连续灭菌）； (4)设备死角(下图) ；,生产上常把不能彻底灭菌的部位称为“死角”,不锈钢衬里破裂造成“死角”,发酵罐罐底脓疱状积垢,罐底的加强板,法兰的“死角” a垫圈内径过小；b垫圈内径过大；c法兰不平造成的泄漏与“死角”,a,b,c,灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法,压力表安装不合理形成“死角” 1,6发酵罐；2缓冲管；3,4压力表；5旋塞,消灭死角 减少挡板和开孔； 焊接光滑； 法兰、阀门连接正好； 减
12、少残渣沉积； 严格清洗和检查；,定期检修易坏部件,化学腐蚀,电化学腐蚀,磨蚀,设备加工不良,4） 防止设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。,防止设备渗漏肉眼可见冷却盘管、夹套穿孔、阀门渗漏 肉眼不可见试漏水压试漏法集气桶来试漏,5）加强操作和卫生管理 严格操作规程、保持环境干净。 提高操作人员素质 温度压力的维持 培养基、传感器,6） 噬菌体污染及其防治措施 染噬菌体对发酵的影响 产生噬菌体的原因：自然界中的噬菌体在活菌体中大量生长。随着风沙尘土和空气流动传播，以及人们的走动、车辆的往来也携带着噬菌体到处传播，使噬菌体潜入生产各个环节，尤其是
13、通过空气系统进入种子室、种子罐、发酵罐。,染噬菌体表现为： 镜检 pH值 发酵液能力：残糖、产物浓度 发酵液性质：泡沫、粘度、气味 OD值 CO2，O2,噬菌体的检测方法 双层琼脂法：在培养皿上倒入培养生产菌的培养基（加琼脂）作下层。同样的培养基中加入2030培养好的种子液，再加入怀疑染噬菌体的发酵液，摇均匀后，铺上层。培养过夜观察培养皿上是否出现噬菌斑。 也可以在上层培养基中不加怀疑染噬菌体的发酵液，而将发酵液直接点种在上层培养基表面，培养过夜，观察有无透明圈出现。,噬菌体的防治车间设计地面环境卫生严格无菌操作 认真进行发酵罐、补料系统的灭菌 废液灭菌排放 选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌种
14、,T4的感染过程,吸附,侵入,复制与聚集,成熟与释放,感染T4后的异常现象：OD值不升反降；耗糖速度降低；氨氮大量释放；,T4感染的防治 净化环境； 光洁地面； 严禁活排； 消除死角； 无菌室少与外界接触； 使用无T4的菌株； 严格种检； 加强管理；,改变菌株或筛选抗T4的菌株； 药物防治(利用药物使T4失活)： (1)螯合剂：抑制吸附或阻止注入； (2)抗生素：抑制T4蛋白质的合成； (3)表面活性剂：抑制T4的吸附； (4)N-脂酰氨基酸：抑制T4复制或子代成熟； (5)聚胺类衍生物：与T4DNA结合，使T4失活；,5 染菌后的挽救措施染菌时间染菌程度最大效益,（1）种子培养期染菌,染菌的
15、特点：生产菌少，防御杂菌能力低，容易污染杂菌。 染菌后的处理：全部废弃培养液,（2）发酵前期染菌,发酵前期最易染菌，且危害最大。 原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。 染菌措施 补救 培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。,（3）发酵中期染菌,影响 干扰产生菌的代谢 改变发酵液环境 措施 降温培养，减少补料 提前放罐 串罐,（4）发酵后期染菌,已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。 措施： 染菌不多，对生产影响不大 染菌严重，破坏性较大，可提前放罐,（5）T4感染后的挽救 并罐法 更换
16、菌种：轮换菌株、抗性菌株 放罐重消，补料，接种 罐内灭菌,染菌的善后 培养基必须灭菌后才可放下水道。灭菌方法：蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。 找到染菌的原因，对症下药，彻底清洗消毒。 染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。,小 结,染菌对发酵的危害： 干扰生产菌的正常代谢，降低产量 改变pH，降解某些产物 污染不同的微生物，不同阶段染菌危害,染菌对提炼的危害： 沉淀出过多杂质 过滤困难而大幅度降低过滤收率 有机溶剂萃取时发生乳化,设备渗漏 空气带菌 种子带菌 灭菌不彻底 技术管理不善,发酵液必须灭菌后才可放下水道 寻找染菌的原因 染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒,产生噬菌体的原因 活菌体随意排放，造成噬菌体的感染源,噬菌体的防治,危害：造成断种，无法生产,建立工厂环境清洁卫生制度 感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间 发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到7080杀死噬菌体，才可排放。 环境用漂白粉消毒 选育抗噬菌体的菌种,思考题 染菌对发酵有什么危害，对提炼有什么危害？ 有哪些原因会引起染菌？ 染菌以后应采取什么措施？ 为什么会感染噬菌体？感染了噬菌体后应采取哪些措施？放线菌发酵：5只大罐，其中两只连续染菌、并且是同样的杂菌（细菌），另外三只正常。请分析可能的原因？,End,
