1、DIN1 DIN 10103 93 m 2794442 0331741 424 m DK 637.5.075 : 579.67285213 DEUTSCHE NORM August 1993 Mikrobiologische Untersuchung von Fleisch und Fleischerzeugnissen Bestimmung von meso p h i I en su If it red u z i e re n d e n CI ost r i d i e n Plattenguverfahren (Referenzverfahren) DIN 10 103 Microb
2、iological analysis of meat and meat products; determination of mesophilic sulfite reducting clostridia; method with poured plates (reference method) Analyse microbiologique de la viande et des produits a base de viande; dtermination des clostridia msophiliques reduisants Sulfit; mthodes densemenceme
3、nt en profondeur (mthode de reference) 1 Anwendungsbereich und Zweck Diese Norm legt ein Referenzverfahren zur Bestimmung der Anzahl von mesophilen sulfitreduzierenden Clostri- dien fest. Das Verfahren ist anwendbar bei Fleisch und Fleischerzeugnissen sowie bei Erzeugnissen mit einem Zusatz von Flei
4、sch und Fleischerzeugnissen. Mit dieser Norm kann darber hinaus die Anzahl von Clo- stridium perfringens innerhalb der Gruppe der mesophi- len sulfitreduzierenden Clostridien nach Abschnitt 8.2.3 bestimmt werden. ANMERKUNG: Ferner ist es mglich, die Anzahl mesophiler sulfitreduzierender Clostridien-
5、Sporen je g oder ml der Probe zu bestimmen (siehe Anmerkung zu Abschnitt 7). 2 Begriff Mesophile sulfitreduzierende Clostridien Mesophile sulfitreduzierende Clostridien sind Bakterien, die nach dem in dieser Norm festgelegten Verfahren in einem Selektivnhrboden schwarze Kolonien bilden und sich durc
6、h GRAM-Frbung als grampositive Stbchen mit typischer Struktur darstellen. 3 Kurzbeschreibung des Verfahrens Jeweils 1 mi der unverdnnten homogenisierten Probe oder der Erstverdnnung und der weiteren Verdnnungen werden in leere Petrischalen eingebracht, in die anschlie- end ein selektiver Nhrboden ge
7、gossen wird. Bei einer Temperatur von 37OC wird unter anaeroben Bedingungen 24 bis 48 h bebrtet. Aus dem Anteil der schwarzen, durch GRAM-Frbung besttigten Kolonien wird die Anzahl mesophiler sulfitreduzierender Clostri- dien je g oder je ml der Probe berechnet. Bei zustzlicher Durchfhrung des Rever
8、se-CAMP- Tests) kann auerdem die Anzahl von Clostridium per- fringens je g oder je ml der Probe innerhalb der Gruppe der mesophilen sulfitreduzierenden Clostridien berechnet werden. oder Trockennhrbden zu verwenden. Den Anweisun- gen des Herstellers ist strikt zu folgen. Das verwendete Wasser mu ent
9、weder in Glasgerten destilliert oder ent- mineralisiert und mindestens von entsprechender Rein- heit sein. Es darf keine Bestandteile enthalten, die das Wachstum von Mikroorganismen beeinflussen. 4.1 Sulfit-Cycloserin-Azid-Agar (SCA-Agar) 4.1.1 Grundnhrboden 4.1.1.1 Zusammensetzung - 150 g Tryptose
10、- 5,O g Pepton aus Sojamehl - 5,O g Hefeextrakt - 5,O g Fleischextrakt - 2,O g Glucose - 0,5 g Ammoniumeisen(II1)-Citrat - 0,5 g Natriummetabisulfit (Na2S205) - 12 bis 15 g Agar, je nach Geliereigenschaften - 1000 ml Wasser 4.1.1.2 Herstellung Die Nhrbodenbestandteile oder der Trockennhrboden werden
11、 in Wasser gelst. Der pH-Wert ist so einzustellen, da er nach dem Sterilisieren bei pH = 7,4 k 0,2 liegt, gemessen bei einer Temperatur von etwa 45OC. Der Nhrboden wird in Portionen zu etwa 100 ml in Kulturkol- ben bergefhrt und 10 min bei 121 OC sterilisiert. Wenn der Nhrboden nicht unmittelbar nac
12、h der Herstellung verwendet wird, ist er im Dunkeln und bei einer Tempera- tur zwischen O und 5OC so aufzubewahren, da keine Vernderungen eintreten knnen. Er darf nicht lnger als 2 Wochen aufbewahrt werden. ANMERKUNG: Es empfiehlt sich, die Chemikalien Ammoniumeisen(II1)-Citrat und Natriummetabisul-
13、 fit getrennt von den brigen Nhrbodenbestandtei- len in wriger Lsung anzusetzen. Dazu werden 0,5 g Ammoniumeisen(II1)-Citrat und 0,5 g Natri- ummetabisulfit in 100 ml Wasser gelst. Die Was- cermenge fr den Grundnhrboden reduziert sich dadurch auf 900 ml. 4 Chemikalien, Nhrbden und Die Nhrbodenbestan
14、dteile und Chemikalien mssen fr mikrobiologische Zwecke geeignet sein. Um vergleich- bare Ergebnisse zu erhalten, sind eindeutig deklarierte Nhrbodenbestandteile und analysenreine Chemikalien Testorganismus l) Das Wort ,CAMP ergibt sich aus den Anfangsbuchsta- ben der Autoren, die das typische Phnom
15、en erstmals beobachteten (Christie, R., N.E. Atkins und E. Munch- Petersen:A note on a lytic phenomenon shown by group B streptococci. The Australian Journal of Experi- mental Biology and Medical Science 22, 197-200 (1944). Fortsetzung Seite 2 bis 5 Normenausschu Lebensmittel und landwirtschaftliche
16、 Produkte (NAL) im DIN Deutsches Institut fr Normung e.V Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin DIN 10103 Aug 1993 Preisgr. 7 08.93 Vertc-Nr. 0007 DINI DIN LOLO3 93 H 2794442 0331742 3b0 Seite 2 DIN 10 103 4.1.2 Cycloserin-Azid-Lsung 4.1.2.1 Zusammensetzung - 1,5 g D-Cycloser
17、in, w = mindestens 97%2)3) - 0,25 g Natriumazid - 50mlWasser 4.1.2.2 Herstellung Die Substanzen werden in Wasser gelst. Die Lsung wird anschlieend durch Filtration sterilisiert und kann bei einer Temperatur zwischen O und 5OC mehrere Monate aufbewahrt werden. 4.1.3 Vollstndiger Nhrboden 4.1.3.1 Zusa
18、mmensetzung - ,100 ml Grundnhrboden nach Abschnitt 4.1.1 - 1 ml Cycloserin-Azid-Lsung nach Abschnitt 4.1.2 4.1.3.2 Herstellung Vor dem Ausgieen des Nhrbodens in die Petrischalen wird die Cycloserin-Azid-Lsung dem auf etwa 45OC abgekhlten Grundnhrboden hinzugefgt und gut ver- mischt. 4.2 Diagnostisch
19、er Sensibilittstest-Blutagar mit einem Volumenanteil von 7 % defibriniertem Schafblut (DST-Agar mit 7% defibriniertem Schaf blu t) 4, 4.2.1 Grundnhrboden 4.21.1 Zusammensetzung - 10,O g Proteose-Pepton - 10,O g Fleischextrakt - 2,O g Glucose - 3,O g Natriumchlorid - 2,O g di-Natriumhydrogenphosphat
20、- 1,O g Natriumacetat - 0,Ol g Adeninsulfat - 0,Ol g Guaninhydrochlorid - 0,Ol g Uracil - 0,Ol g Xanthin - 0,00002 g Thiaminhydrochlorid - 12 bis 15 g Agar, je nach Geliereigenschaften - 1 O00 ml Wasser 4.2.1.2 Herstellung Die Nhrbodenbestandteile oder der Trockennhrboden werden in Wasser gelst. Der
21、 pH-Wert ist so einzustellen, da er nach dem Sterilisieren bei pH = 74 f 0,l liegt, gemessen bei einer Temperatur von etwa 45OC. Der Nhrboden wird in Kulturkolben bergefuhrt und 15 min bei 121 OC sterilisiert. Wenn der Nhrboden nicht unmittel- bar nach der Herstellung verwendet wird, ist er im Dunke
22、ln und bei einer Temperatur zwischen O und 5OC so aufzubewahren, da keine Vernderungen eintreten knnen. Er darf nicht lnger als 2 Wochen aufbewahrt werden. 4.2.2 Schafblut Selbstgewonnenes defibriniertes Schafblut zur unmittel- baren Verwendung oder steriles defibriniertes Schafblut aus dem Handel.
23、4.2.3 Vollstndiger Nhrboden Zur Herstellung des vollstndigen Nhrbodens werden dem verflssigten, auf etwa 45OC temperierten Grund- nhrboden nach Abschnitt 4.2.1 70 ml Schafblut (Raum- ternperatur) unter sterilen Bedingungen zugegeben und gut vermischt. 4.2.4 Herstellen der Agarplatten Teilmengen von
24、etwa 15 ml des vollstndigen Nhrbo- dens werden in Petrischalen bergefhrt und zum Verfe- stigen stehengelassen. Im voraus hergestellte Platten drfen nicht lnger als 4 h bei Raumtemperatur oder einen Tag bei einer Temperatur zwischen O und 5OC auf- bewahrt werden. Sofern die Platten gegen Austrocknung
25、 geschtzt werden, sind sie bei einer Lagertemperatur zwischen O und 5OC bis zu 7 Tage verwendbar. Unmittelbar vor der Verwendung werden die Platten mit der Agaroberflche nach unten, schrg auf dem abge- nommenen Deckel liegend, in einem Brutschrank etwa 30 min bei Vorzugsweise 50 OC getrocknet. Alter
26、nativ kn- nen die Platten bei 37OC etwa 60 min getrocknet werden. 4.3 Verdnnungslsung Nach DIN 10162 4.4 Physiologische Kochsalzlsung 4.4.1 Zusammensetzung - 8,5 g Natriumchlorid - 1 O00 ml Wasser 4.4.2 Herstellung Das Natriumchlorid wird in Wasser gelst und in einem Kulturkolben 20 min bei 121 OC s
27、terilisiert. 4.5 Testorganismus Als Indikatorstamm fr den Reverse-CAMP-Test wird ein hmolysierender Streptococcus agalactiae (Referenz- stamm z.B. DSM 2134, der ATCC 13813 und NCTC 8181 entspricht) verwendet, der mit a-toxinproduzierenden C. perfringens eine typische b-hmoiytische Reaktion auf DST-A
28、gar mit 7 % defibriniertem Schafblut nach Bebr- tung zeigt. 5 Gerte Alle Glasgerte mssen vor der Verwendung sorgfltig gereinigt und sterilisiert werden. Kunststoffgerte mssen steril sein. Zustzlich zu den in DIN 10162 aufgefhrten Gerten werden die Gerte nach den Abschnitten 5.1 und 5.8 bentigt. ANME
29、RKUNG: Mechanische Pipetten und andere Gerte fr die mechanisierte und automatisierte Durchfhrung der Arbeitsvorgnge drfen verwen- det werden, sofern durch entsprechende Unter- suchungen sichergestellt ist, da vergleichbare Ergebnisse erzielt werden knnen. 5.1 Brutschrank, einstellbar auf 5OoC 5.2 Br
30、utschrank, einstellbar auf (37 f I)OC, z. E. Brut- schrank nach DIN 58 945 Teil 1 *) w = Massenanteil 3, Nach dem jeweils gltigen Arzneibuch 4, Auskunft ber Bezugsquellen fr geeignete Basis- Trockennhrbden erteilt der Normenausschu fr Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN, 10772
31、 Berlin. DINI DIN LOLO3 93 5.3 bden auf geeignete Temperaturen Wasserbder zum Erhitzen und Khlen der Nhr- 5.4 schalen nach DIN 12 339 Petrischalen, Durchmesser etwa 9 cm, z. B. Petri- 5.5 anaerober Verhltnisse Geeignete Gefe und Gerte zur Herstellung 5.6 Impfse 5.7 Objekttrger 5.8 Mikroskop 6 Proben
32、ahme Nach DIN 10 162 7 Durchfhrung Die Zeitspanne vom Beginn der Herstellung der Erst- Verdnnung nach Abschnitt 7.3 bis zur Beimpfung des Nhrbodens nach Abschnitt 7.5 darf 30 min nicht ber- schreiten. ANMERKUNG: Falls die Anzahl mesophiler sulfit- reduzierender Clostridien-Sporen je g bzw. ml der Pr
33、obe ermittelt werden soll, ist es erforderlich, das Probenmaterial (unverdnnte flssige oder ver- dnnte Probe) vorab einer Erhitzung (Pasteurisie- rung) bei 8OoC ber 10 min zu unterziehen. 7.1 Vorbereitung der Verdnnungsrhrchen Nach DIN 10162 und -kolben 7.2 Vorbereitung der Probe Nach DIN 10 162 7.3
34、 Herstellung der Erstverdnnung Nach DIN 10 162 7.4 Herstellung weiterer Dezimalverdnnungen Nach DIN 10162 7.5 Beimpfung Die Verdnnungsreihe wird im Doppelansatz untersucht. Mit einer Pipette wird jeweils 1 ml der unverdnnten, homogenisierten Probe oder der Erstverdnnung und der weiteren Verdnnungen
35、in leere Petrischalen bergefhrt. Dabei ist mit der hchsten Verdnnung zu beginnen. Innerhalb von 5 min werden in jede Petrischale etwa 20 ml des geschmolzenen, auf etwa 45OC abgekhlten Nhrbodens nach Abschnitt 4.1.3 gegossen. Der Nhrboden wird mit der Impfmenge grndlich ver- mischt. Es ist darauf zu
36、achten, da die Petrischalen beim Ver- festigen in horizontaler Lage sind. 7.6 Bebrtung Die Platten werden unter anaeroben Bedingungen, jedoch nicht unter Vakuum, mit dem Boden nach oben 24 bis 48 h bei einer Temperatur von 37OC im Brut- - 2774442 0333743 2T7 - DIN 10103 Seite 3 Schrank nach Abschnit
37、t 5.2 bebrtet. Dabei ist besonders darauf zu achten, da die beimpften Platten so schnell wie mglich, sptestens jedoch nach 30 min, unter an- aerobe Bedingungen zu bringen sind, da Clostridien gegenber Sauerstoffzutritt sehr empfindlich reagieren. ANMERKUNG: Lngere Bebrtungszeiten knnen bei Anwesenhe
38、it eines berwiegenden Anteils von Clostridium perfringens zu einer bermigen Schwrzung am Bodenrand der Platte fhren. 8 Auswertung 8.1 Zhlen der Kolonien Nach Ablauf der Bebrtungszeit wird die Anzahl der schwarzen Kolonien jeder Platte bestimmt. 8.1.1 Beim Zhlen werden nur solche Platten berck- sicht
39、igt, auf denen sich 1 bis 150 Kolonien gebildet haben. Bei kleinen und gut auszhlbaren Kolonien knnen auch Platten mit bis zu 200 Kolonien herangezogen werden. 8.1.2 Wenn weniger als 15 schwarze Kolonien bei den Platten mit einer unverdnnten, homogenisierten Probe oder mit der niedrigsten Dezimalver
40、dnnung (Erstverdn- nung) vorhanden sind, werden diese Platten zur Scht- zung der Zahl mesophiler sulfitreduzierender Clostridien bzw. Clostridium perfringens herangezogen. 8.2 Besttigung 8.2.1 Auswahl der Kolonien Von einer der nach den Abschnitten 8.1.1 oder 8.1.2 aus- gezhlten Platten werden 10 gu
41、t abgesetzte schwarze Kolonien ausgewhlt. Sind auf einer Platte eines Doppel- ansatzes weniger als 10 schwarze Kolonien vorhanden, ist die andere Platte der gleichen Verdnnungsctufe mit heranzuziehen. Sind auf den Platten einer Verdnnungs- stufe weniger als 10 schwarze Kolonien vorhanden, sind alle
42、Kolonien zu verwenden. 8.2.2 Prfung auf mesophile sulfitreduzierende Clostridien Jede der ausgewhlten Kolonien wird mit der Impfse aus dem Agar entnommen, auf einem Objekttrger in physiologischer Kochsalzlsung nach Abschnitt 4.4 ver- rieben und nach GRAM gefrbt. ANMERKUNG: Soll zustzlich auf das Vor
43、handen- sein von Clostridium perfringens geprft werden, wird aus der Keimsuspension vor der Frbung erst der DST-Agar mit 7% defibriniertem Schafblut nach Abschnitt 4.2 beimpft. Als mesophile sulfitreduzierende Clostridien gelten schwarze Kolonien dann, wenn die mikroskopischen Ausstriche das Vorlieg
44、en einer der folgenden Befunde ergeben haben: a) grampositive bis gramlabile Stbchen mit oder ohne Sporen b) gramlabile bis gramnegative Stbchen mit Spo- renausbildung. 8.2.3 Prfung auf Clostridium perfringens Fr die zustzliche Besttigung von C. perfringens wird der Reverse-CAMP-Test herangezogen. M
45、it Hilfe einer Impfse wird der Indikatorstamm nach Abschnitt 4.5 auf eine Platte nach Abschnitt 4.2.4 ber die Mitte der Petrischale als durchgehender Impfstrich aufgetragen. Im Abstand von 1 mm zu diesem Impfstrich werden beidseitig im rechten Winkel parallele Impfstriche der zu prfenden Keimsuspens
46、ionen nach Abschnitt 8.2.2 aufgetragen. DINL DIN LO LO 93 m 2794442 0331,744 133 m Seite 4 DIN 10103 =Indi katorstamm ,Pfeilspitzen- Phnomen “ Bild 1 : Reverse-CAMP-Test Die Parallelausstriche sollten nicht nher als 2 cm bei- einanderliegen. Fr 10 Besttigungsreaktionen sind daher 2 DST-Agarplatten e
47、rforderlich. Die Platten werden unter anaeroben Bedingungen (z. B. Anaerobiertopf) mit dem Boden nach oben 18 bis 24 h bei 37OC bebrtet. Als C. perfringens gelten die geprften Kolonien dann, wenn sich nach Ablauf der Bebrtungszeit pfeilspitzen- frmige Aufhellungen (PHmolyse) im Bereich der im rechte
48、n Winkel zusammenfhrenden Impfstriche ausge- bildet haben. 8.3 Berechnung der Keimzahl Bei der Berechnung der Keimzahlen wird der Anteil der in den Besttigungen positiven Kolonien bercksichtigt. 8.3.1 Wenn mindestens 80% der nach Abschnitt 8.2.1 ausgewhlten Kolonien nach Abschnitt 8.2.2 bzw. Abschni
49、tt 8.2.3 besttigt wurden, werden die nach Abschnitt 8.1 ermittelten Koloniezahlen als Anzahl der Kolonien von mesophilen sulfitreduzierenden Clostridien bzw. C. perfringens gewertet. 8.3.2 In allen anderen Fllen wird die Anzahl der Kolo- nien nach dem prozentualen Anteil der positiven Bestti- gungsreaktionen berechnet. 8.3.3 Es werden Platten aus den Verdnnun
