1、April 2007DEUTSCHE NORM Normenausschuss Materialprfung (NMP) im DINFachausschuss Minerall- und Brennstoffnormung (FAM) des NMPPreisgruppe 8DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, g
2、estattet.ICS 07.100.99; 75.160.20!,qF3“9783516www.din.deDDIN 51441Prfung von Minerallerzeugnissen Bestimmung der Kolonienzahl in Minerallerzeugnissen imSiedebereich unterhalb von 400 CTesting of mineral products Determination of the microbial colony number in petroleum products with a boiling rangeb
3、elow 400 CEssai des produits ptroliers Dtermination du nombre de microorganismes viables dans les produits ptroliers depoint dbullition infrieur 400 CAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 12 SeitenDIN 51441:2007-04 Inhalt Seite Vorwort .3 1 Anwendung
4、sbereich 3 2 Normative Verweisungen.3 3 Kurzbeschreibung des Verfahrens .4 4 Chemikalien.4 5 Gerte und Prfmittel .4 6 Nhrbden .5 7 Vorbereitung der Gerte 6 8 Probenahme 7 9 Durchfhrung7 10 Auswertung .9 11 Ergebnisangabe9 12 Przision 11 13 Entsorgung der Nhrbden .12 2 DIN 51441:2007-04 Vorwort Diese
5、 Norm wurde vom Arbeitsausschuss NA 062-06-42 AA Prfung von flssigen Kraftstoffen und Heizlen“ im Fachausschuss Minerall- und Brennstoffnormung (FAM) des Normenausschusses Material-prfung (NMP) ausgearbeitet. 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein Verfahren fest zur Bestimmung lebender Mikroorganis
6、men wie Bakterien, Hefen und Pilze in flssigen Minerallprodukten wie z. B. Heizl, Dieselkraftstoff, Flugturbinenkraftstoff und FAME (Fatty Acid Methyl Esters) und deren Komponenten im Siedebereich unterhalb von 400 C sowie die mit diesen Produkten in Kontakt stehenden wssrigen Phasen. Der Messbereic
7、h dieses Verfahrens umfasst den Bereich 220 cfu/l bis 106cfu/l fr die Minerall-Phase und den Bereich 10 cfu/ml bis 106cfu/ml fr die wssrige Phase. ANMERKUNG cfu: colony forming units. In Gegenwart von Wasser kann es in Mitteldestillat-Lagertanks zu bermigem Wachstum von allgegenwrtigen Mikroorganism
8、en (Bakterien, Hefen und Pilzen) kommen. Hierdurch kann eine Vielzahl von Problemen in der Infrastruktur sowie in Fahrzeugen durch Korrosion und/oder Filterverstopfungen verursacht werden. Diese Norm legt die Probenahme, die Bestimmung sowie die Auswertung der mikrobiologischen Belastung (Keimzahl),
9、 bestehend aus Bakterien, Hefen und Pilzen in den im ersten Absatz genannten Erzeugnissen, fest. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweis
10、ungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN 1333, Zahlenangaben DIN 12697, Laborgerte aus Glas Messpipetten, schnellablaufend, Wartezeit 15 Sekunden, Klasse AS DIN 12699, Laborgerte aus Glas Enzymtest-Messpipetten, schnellablaufend, Wartezeit
11、15 Sekunden, Klasse AS DIN 51750-2, Prfung von Minerallen Probenahme Teil 2: Flssige Stoffe DIN 58945-1, Brutschrnke fr mikrobiologische Zwecke Teil 1: Begriffe, Anforderungen, Anwendung DIN EN ISO 4788, Laborgerte aus Glas Messzylinder und Mischzylinder 3 DIN 51441:2007-04 3 Kurzbeschreibung des Ve
12、rfahrens Ein Probenteil (90 ml) wird mit 10 ml einer Salzlsung (viertelstarke Ringer-Lsung, siehe 4.2) ausgeschttelt. Mit Hilfe einer sterilen Pipette werden anschlieend 0,1 ml, 0,2 ml oder 0,5 ml der erhaltenen wssrigen Phase auf geeignete Nhrbden aufgetragen. Der beimpfte Nhrboden wird mindestens
13、72 h bis maximal 120 h in einem Brutschrank bei 25 C bis 27 C bebrtet. Unter diesen Bedingungen entwickeln sich die vorhandenen Mikroorganismen so, dass sie durch Auszhlen erfasst werden knnen. Die Anzahl der gebildeten Bakterien, Hefen und Pilze lsst Rckschlsse auf die Belastung der Probe mit Mikro
14、organismen zu. 4 Chemikalien 4.1 Alkalische Reinigungslsung 4.2 keimfreie Salzlsung (viertelstarke Ringer-Lsung), die in einem keimfreien Gebinde bei einer dunklen Lagerung max. 4 Wochen verwendbar ist. Diese Salzlsung hat die Zusammensetzung: Natriumchlorid, NaCl 2,25 g Kaliumchlorid, KCl 0,105 g C
15、alciumchlorid CaCl2 6 H2O 0,12 g Natriumhydrogencarbonat, p.a. 0,05 g Wasser, bidestilliert 1 l Die Salzmischung ist in Tablettenform auch im Handel erhltlich. In diesem Teil wird die Salzlsung durch Auflsen von zwei Ringertabletten in 1 l bidestilliertem Wasser hergestellt. Das verwendete Wasser da
16、rf nicht aus einem Ionentauscher entnommen werden. Die resultierende Lsung, blicherweise Ringerlsung genannt, muss keimfrei sein, was durch entsprechende Sterilisation in einem Autoklaven bei etwa 120 C erreicht werden kann. 4.3 n-Heptan oder Petroleumbenzin (Siedebereich 40 C bis 80 C), reinst 4.4
17、Aceton, technisch 4.5 Stickstoff, Massenanteil w 99,9 % 4.6 Salzsure, c(HCl) = 1 mol/l 4.7 Natriumhydroxid-Lsung, c(NaOH) = 0,1 mol/l 5 Gerte und Prfmittel 5.1 Messpipette 1,0 ml, nach DIN 12697 oder DIN 12699 mit blauem Farbstreifen, Skalenteilungswert 0,01 ml, Klasse AS (schnell ablaufend aus durc
18、hsichtigem Glas). Alternativ darf auch eine Einwegspritze mit langer, steriler Einwegkanle verwendet werden. 5.2 Glasstbe etwa 20 cm lang, Durchmesser etwa 3 mm, wobei 2 cm des Glasstabes mit Hilfe des Gasbrenners (siehe 4.4) im rechten Winkel abzubiegen sind 5.3 Mischzylinder mit Glasstopfen, Nennv
19、olumen, Skalenteilungswert 1 ml, z. B. nach DIN EN ISO 4788 4 DIN 51441:2007-04 5.4 Gasbrenner 5.5 Brutschrank z. B. nach DIN 58945-1, regelbar zwischen 25 C 1 C und 27 C 1 C 5.6 Dampf-Sterilisator (Autoklav) oder Trockenschrank (mit einem Temperaturbereich bis min. 180 C) als Sterilisationsmglichke
20、it 5.7 Glasflasche als Probegebinde 5.8 Wasserfester Filzschreiber 5.9 Pipettenbox aus Aluminium Durchmesser 6 cm, Lnge 40 cm 5.10 Aluminiumbox 26 cm 15 cm mit Deckel 5.11 Pipettierhilfe, z. B. Peleusball 5.12 Probenahmegert nach DIN 51750-2 5.13 Sterile Einmalhandschuhe 5.14 Entsorgungsbeutel, z. B
21、. Fa. Greiner, Labortechnik1)5.15 Zhlhilfe, z. B. TEC NO MARA, Countboy ACU, Zrich/Schweiz1)5.16 Lupe zum Auszhlen der Kolonien 5.17 Keimfreies Tuch, z. B. Zellstoff 5.18 Petrischale, 90 ml, mit Deckel 5.19 pH-Messgert mit flacher Oberflchen-Elektrode, geeignet zum Messen des ph-Wertes auf 0,1 6 Nhr
22、bden 6.1 Allgemeines Die Nhrbden mssen bei Verwendung eine Temperatur von 20 C bis 27 C haben. Die Nhrbden sind auch als Fertigprodukte im Handel aus verschiedenen Quellen erhltlich. Bei Verwendung solcher Fertig-Nhrbden muss auf die vorgeschriebene Lagerung (Lagerort, Lagertemperatur, Verfallsdatum
23、) geachtet werden. 6.2 CASO-AGAR (Trypton-Soja-Agar TSA Sojabohnen-Kasein-digerierter Agar) Dieser Nhrboden begnstigt das Wachstum von Bakterien. Hefen und Schimmel knnen sich ebenfalls entwickeln, aber blicherweise nicht so ausgeprgt wie auf dem selektiven MEA-Nhrboden (siehe 6.3). Die Zusammensetz
24、ung ist: Trypton 15,0 g/l Soja Pepton 5,0 g/l 1) Dies ist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung dieses genannten Produktes durch das DIN.5 DIN 51441:2007-04 Natriumchlorid 5,0 g/l Agar 1
25、5,0 g/l 40 g des TSA werden in 1 Liter destilliertem Wasser suspendiert und zum Sieden erhitzt, bis sich alles gelst hat. Die Lsung wird 15 min in einem Autoklav (siehe 5.6) bei (120 2) C sterilisiert. Etwa 20 ml dieser Lsung werden in eine 90-ml-Petrischale (siehe 5.18) gefllt und mit dem Deckel ve
26、rschlossen. Nach Abkhlen auf Raumtemperatur (etwa 20 C) wird der pH-Wert des Nhrbodens mit Hilfe einer flachen Oberflchenelektrode und eines pH-Messgertes gemessen. Liegt der pH-Wert auerhalb des geforderten Bereichs pH = (7,3 0,3), wird die Charge verworfen und eine neue Mischung hergestellt. TSA w
27、ird in dehydrierter Form von verschiedenen Herstellern angeboten. Wenn ein derartiges Material eingesetzt wird, mssen die Herstellerangaben hinsichtlich der Sterilisation befolgt werden. Ebenso bieten verschiedene Hersteller Fertig-Nhrbden an, die zur Kultivierung eines breiten Bakterienspektrums ei
28、ngesetzt werden knnen (z. B. Fa. Merck)2). Alternative Nhrbden sind nicht zugelassen. 6.3 MALZ-EXTRAKT-AGAR MEA Der pH-Wert dieses Nhrbodens begnstig das Wachstum von Pilzen (Schimmel und Hefen) gegenber dem der Bakterien. Die Zusammensetzung ist: Malzextrakt 30,0 g/l Mykologisches Pepton 5,0 g/l Ag
29、ar 15,0 g/l 50 g des MEA werden mit destilliertem Wasser auf 1 Liter aufgefllt und zum Sieden erhitzt, bis sich alles gelst hat. Der pH-Wert wird mit Hilfe der Salzsure (siehe 4.6) und/oder Natriumhydroxidlsung (siehe 4.7) eingestellt. Die Lsung wird 10 min in einem Autoklav (siehe 5.6) bei (115 2)
30、C sterilisiert. Nach dem Abkhlen auf etwa 50 C werden etwa 20 ml der Lsung in eine 90-ml-Petrischale (siehe 5.18) gefllt und der Deckel verschlossen. Nach Abkhlen auf Raumtemperatur (etwa 20 C) wird der pH-Wert des Nhrbodens mit Hilfe einer flachen Oberflchenelektrode und eines pH-Messgertes gemesse
31、n. Liegt der pH-Wert auerhalb des geforderten Bereichs (pH = (5,4 0,2), wird die Charge verworfen und eine neue Mischung hergestellt. MEA wird in dehydrierter Form von verschiedenen Herstellern inhibiert und nicht inhibiert angeboten. Es drfen nur nicht inhibierte Nhrbden fr die Prfung eingesetzt we
32、rden. Wenn ein derartiges Material eingesetzt wird, mssen die Herstellerangaben hinsichtlich der Sterilisation befolgt werden. Verschiedene Hersteller bieten Fertig-Nhrbden zum Nachweis und zur Isolierung insbesondere von Hefen und Schimmelpilzen an. Diese Fertigbden sind meist nicht inhibiert (z. B
33、. Fa. Merck)2). Alternative Nhrbden sind nicht zugelassen. 7 Vorbereitung der Gerte 7.1 Die Glasgerte werden mit der Reinigungslsung (siehe 4.1) gesubert und mit bidestilliertem Wasser klargesplt. Anschlieend werden die Glasgerte mit Hilfe eines Dampf-Sterilisators (Autoklav) in der Aluminiumbox bzw
34、. Pipettenbox nach den Vorgaben des jeweiligen Herstellers sterilisiert. Falls kein Dampfsterilisator (Autoklav) zur Verfgung steht, knnen die Glasgerte 2 h bei 180 C in einem Trocken-schrank sterilisiert werden. 7.2 Das Probenahmegert wird mit n-Heptan oder Petroleumbenzin gesplt, anschlieend mit A
35、ceton nachbehandelt und mit Stickstoff getrocknet. 2) Dies ist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung dieses genannten Produktes durch das DIN. 6 DIN 51441:2007-04 7.3 Alle nach 7.1 bzw.
36、7.2 sterilisierten Gerte stehen maximal 2 Tage nach der Sterilisation zur Probenahme/Durchfhrung der Bestimmung zur Verfgung. Nach lngerer Lagerzeit sind die Gerte erneut zu sterilisieren. 7.4 Ist fr das Probenahmegert eine Vorgehensweise wie unter 7.2 beschrieben nicht mglich (kleinere Lger), so ka
37、nn ausnahmsweise auch wie folgt verfahren werden: Mit dem von anhaftenden Verunreinigungen befreiten Probenahmegert wird dreimal hintereinander eine Probe aus dem zu beprobenden Tank gezogen. Die beiden ersten Muster werden verworfen. Die dritte Probe dient zur Durchfhrung der Keimzahlbestimmung. 8
38、Probenahme Als Probebehlter werden entweder neue ungebrauchte oder im Laborgeschirrspler gereinigte Glasflaschen von max. 1 l Volumen bzw. neue ungebrauchte Einweg-Blechgebinde verwendet. Die Probenahme erfolgt mit einem Probenahmegert nach DIN 51750-2 in der Hhe ber dem Tankboden, in der die Absaug
39、leitung liegt, die zur Verladebhne fhrt. Bei schwimmender Absaugung sind die Proben in der Hhe zu ziehen, welche dem tiefsten Punkt dieser Absaugung entspricht. Ferner sollte eine Probe mit der Tauchbombe vom Tankboden gezogen werden (auf Peilplatte achten), welche sowohl eine Minerall- als auch ein
40、e Wasserphase enthalten sollte. Diese Wasserphase wird nach dem Abtrennen des Minerallbestandteils zur Bestimmung der Kolonienzahl eingesetzt. Wenn das Tankbodenmuster ausschlielich aus einer Wasserphase besteht, ist erst der Tank, dem die Probe entnommen wurde, zu entwssern und anschlieend mit eine
41、m nach 7.2 gereinigten Probenahmegert eine erneute Probenahme durchzufhren. Umgehend nach erfolgter Probenahme ist die Probe dunkel bei einer Temperatur, wenn mglich, von max. 10 C bis zum schnellstmglichen Transport zu lagern. Die Zeitspanne zwischen Probenahme und dem Ansatz der Bestimmung darf ni
42、cht lnger als 48 h betragen. 9 Durchfhrung 9.1 Vor Beginn der Bestimmung sind die sterilen Einmalhandschuhe anzuziehen und es ist darauf zu achten, dass am Arbeitsplatz mglichst geringe Luftturbulenzen herrschen. 9.2 Die Probe wird visuell auf freies Wasser geprft. Ist eine freie Wasserphase vorhand
43、en das ist hufig bei Tankbodenproben der Fall, wird sie durch vorsichtiges Dekantieren von der Minerallphase getrennt. Die Wasserphase kann dann separat untersucht werden (siehe 9.9). 9.3 90 ml der Minerallphase (siehe 9.2) werden in einen 100-ml-Mischzylinder gefllt und mit 10 ml Salzlsung (siehe 5
44、.2) unterschichtet. Der Mischzylinder wird mit einem Glasstopfen verschlossen und 30 s krftig manuell geschttelt und anschlieend etwa 10 min stehen gelassen. 9.4 Von der wssrigen Phase wird mit einer 1-ml-Messpipette mehr als 1 ml aus dem Mischzylinder entnommen. Hierzu wird eine Pipettierhilfe (sie
45、he 5.11) auf die Pipette aufgesetzt und die Pipette dann verschlossen so in die Minerallphase gefhrt, bis sie in die wssrige Phase eintaucht. Dann wird die wssrige Phase ber die 0-Graduierung hinaus angesaugt. Die Pipette wird aus dem Mischzylinder entnommen, mit einem keimfreien Tuch (siehe 5.17) v
46、on auen vom Minerallprodukt befreit und mehr als 0,1 ml der angesaugten Flssigkeit verworfen. 9.5 Dann wird eine Testreihe wie folgt angesetzt. Auf die bereitgestellten CASO-Fertigbden (siehe 6.2), welche schon etwa 1 h vor Testbeginn auf eine Temperatur von 20 C bis 27 C erwrmt worden sind, werden
47、aus der Pipette je 0,1 ml, 0,2 ml oder 0,5 ml tropfenweise auf die Mitte der Nhrbodenflche gegeben. 7 DIN 51441:2007-04 Nachdem die wssrige Phase auf die Nhrbden gegeben wurde, kann mit dem nachfolgend beschriebenen Ausspateln (siehe Bild 1) begonnen werden. Bei Schiedsanalysen sind die Anstze mit 0
48、,1 ml, 0,2 ml und 0,5 ml durchzufhren Die wssrige Phase wird gleichmig auf die gesamte Agar-Schicht ausgestrichen, indem der gebogene Glasstab mittels Schlangenlinie von einem Rand der Agar-Platte zum gegenberliegenden gefhrt wird. Dabei ist darauf zu achten, dass die Schlangenlinie die gesamte Breite des Nhrbodens einbezieht und dass das gebogene Ende des Glasstabes parallel zur Nhrbodenoberflche und ohne Druck gefhrt wird, damit diese nicht beschdigt wird. Anschlieend wird das Ausstreichen nach einer Vierteldrehung des Nhrbodens wiederholt, bis die gesamte F
