1、Oktober 2007 Preisgruppe 11DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nurICS 67.050!,x2G“www.din.deDDIN-Fachbericht CEN/TR 15641Lebensmitteluntersuchung Bestimmung von Pestizidrckstnden mit LC-MS/MS Parameter fr die Tandem-Massenspektrometrie;Deutsche Fas
2、sung CEN/TR 15641:2007Food analysis Determination of pesticide residues by LC-MS/MS Tandem mass spectrometric parameters;German version CEN/TR 15641:2007Analyse des produits alimentaires Dtermination des rsidus de pesticides par CL-MS/MS Paramtres de spectromtrie de masse en tandem;Version allemande
3、 CEN/TR 15641:2007Alleinverkauf durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlinwww.beuth.deGesamtumfang 25 Seitenmit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.9851536DIN CEN/TR 15641:2007-10 2 Nationales Vorwort Der vorliegende DIN-Fachbericht ist die Deutsche Fassung des vom
4、Technischen Komitee TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren“ (Sekretariat: DIN, Deutschland) des Europischen Komitees fr Normung (CEN) nach eingehenden Vorarbeiten der Arbeitsgruppe 4 Pestizide in pflanzlichen Lebens-mitteln“ ausgearbeiteten Technischen Berichtes CEN/TR 15641:2007. Die Mit
5、arbeit des DIN wird fr den Bereich des CEN/TC 275/WG 4 durch den Arbeitsausschuss NA 057-01-08 AA Pestizide“ des Normenausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) wahrge-nommen. Deutsche Experten aus dem Arbeitsausschuss NA 057-01-08 AA Pestizide“ des Normenausschusses Lebensmitt
6、el und landwirtschaftliche Produkte (NAL) haben mageblich an diesem Papier mitgewirkt. TECHNISCHER BERICHT TECHNICAL REPORT RAPPORT TECHNIQUE CEN/TR 15641 August 2007 ICS 67.050 Deutsche Fassung Lebensmitteluntersuchung - Bestimmung von Pestizidrckstnden mit LC-MS/MS - Parameter fr die Tandem-Massen
7、spektrometrie Food analysis - Determination of pesticide residues by LC-MS/MS - Tandem mass spectrometric parameters Analyse des produits alimentaires - Dtermination des rsidus de pesticides par CL-SM/SM - Paramtres de spectromtrie de masse en tandem Dieser Technische Bericht (TR) wurde vom CEN am 2
8、5.Juli 2007 als eine knftige Norm zur vorlufigen Anwendung angenommen. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwe
9、gen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern. Management-Zentrum: rue de Stassart, 36 B-1050 Brssel 2007 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welche
10、m Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten. Ref. Nr. CEN/TR 15641:2007 DEUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATION EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG CEN/TR 15641:2007 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort3 Einleitung4 1 Anwendungsbereich5 2 Analyt-spezifis
11、che Parameter fr das selective reaction monitoring“ von Pestiziden 5 2.1 Allgemeines5 2.2 LC-Parameter .5 2.3 Allgemeine MS/MS-Parameter .6 2.4 Analyt-spezifische MS/MS-Parameter .7 Literaturhinweise23 CEN/TR 15641:2007 (D) 3 Vorwort Dieses Dokument (CEN/TR 15641:2007) wurde vom Technischen Komitee
12、CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diesen Europischen Technischen Bericht anzukndigen: Belgien, Bulgarien, Dnemar
13、k, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. CEN
14、/TR 15641:2007 (D) 4 Einleitung In der Pestizidrckstands-Analyse werden Multiverfahren angewandt, bei denen die Rckstnde aus Lebensmitteln extrahiert und diese Extrakte in der Art gereinigt werden, dass so viele Pestizidrckstnde wie mglich in den Extrakten enthalten sind. Anschlieend knnen die Extra
15、kte mit verschiedenen Gerten untersucht werden. Am hufigsten werden die Flssigchromatographie (LC) und die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) miteinander kombiniert, da sie universelle, und gleichzeitig selektive und empfindliche Techniken fr die Identifizierung und quantitative Bestimmung von Pesti
16、zidrckstnden in Lebensmittel-Extrakten sind. Fr die Ionisation der Analyten (M) bei der LC-MS/MS wird zumeist die Elektrospray-Ionisation (ESI) oder die chemische Ionisation unter Atmosphrendruck (APCI) verwendet. Je nach der ausgewhlten Polaritt der Ionisation entstehen protonierte oder deprotonier
17、te Moleklionen wie M+H+oder MH. Bei Verwendung der ESI knnen relativ stabile Addukte (Cluster) der Analyte (M) mit Bestandteilen der mobilen Phase wie Ionen (z. B. Ammonium-, Natrium- oder Kaliumionen) oder Lsemittelmolekle (z. B. Methanol) zustzlich gebildet werden. Um einen hohen Anteil an Quasi-M
18、oleklionen“ zu erhalten und damit die Empfindlichkeit der Messungen zu erhhen, mssen diese Cluster aufgebrochen werden. Bei Verwendung der ESI werden die gebildeten Addukte durch eine Spannung (blicherweise bezeichnet als declustering potential“ oder cone voltage“) in der Ionenquelle bei Normaldruck
19、 beschleunigt. Aufgrund der Kollision mit den Neutralgas-Moleklen werden die Cluster (Addukte) in der Ionenquelle aufgebrochen. Unter bestimmten Bedingungen sind einige Addukt-Ionen stabil (z. B. mit Ammonium-Kation M+NH4+). Es sollte jedoch angemerkt werden, dass Ammonium-Addukte blicherweise nicht
20、 im APCI-Modus entstehen und dass ihre Bildung bei der Verwendung von ESI stark von der Konzentration der Ammonium-Ionen in der mobilen Phase der Flssigchromatographie abhngt. Addukt-Ionen wie M+NH4+ knnen auch alternativ fr die Quantifizierung verwendet werden, wenn gezeigt werden kann, dass ihre S
21、ignale reproduzierbar sind. Natrium-Addukte sind blicherweise nicht fr die Quantifizierung geeignet, da sie sehr wenig reproduzierbar gebildet oder zersetzt werden. Die selektive Bestimmung jedes Analyten erfolgt durch Messung von charakteristischen Produkt-Ionen des Precursor-Ions“ (Quasi-MolekIion
22、 oder Addukt) im selected reaction monitoring“ (SRM). Eine Fragmen-tierung der Precursor-Ionen in der Kollisionszelle wird durch die Zusammenste mit Moleklen des Kollisionsgases (Stickstoff oder Argon) hervorgerufen. Die Kollisionsenergie (CE), die fr die Fragmentierung erforderlich ist, ist ein seh
23、r grundlegender Parameter der MS/MS-Optimierung fr die maximale Empfind-lichkeit. Wenn die LC-MS/MS nicht nur fr quantitative Bestimmungen, sondern auch fr die Absicherung positiver Befunde herangezogen werden sollte, mssen mindestens zwei SRM-Massenbergnge aufgenommen werden. CEN/TR 15641:2007 (D)
24、5 1 Anwendungsbereich Dieser Technische Bericht listet massenspektrometrische Parameter auf, die hilfreich sind fr die Anwendung der Europischen Normen fr die Bestimmung von Pestizidrckstnden in Lebensmitteln pflanzlichen Ursprungs, die die LC-MS/MS verwenden, wie z. B. die Normen in Vorbereitung: p
25、rEN 15637 Pflanzliche Lebensmittel LC-MS/MS-Verfahren zur Bestimmung von Pestizidrckstnden mit Methanolextraktion und Reinigung an Diatomeenerde“ prEN 15662 Pflanzliche Lebensmittel Bestimmung von Pestizidrckstnden mit GC-MS und/oder LC-MS(/MS) nach Acetonitril-Extraktion/Verteilung und Aufreinigung
26、 mit dispersiver SPE QuEChERS-Verfahren“ Um die Bestimmung aktiver Substanzen und/oder Metaboliten mit der LC-MS/MS zu erleichtern, listet die Tabelle 1 die fr die Quantifizierung geeigneten Precursor-Ionen und die Produktionen, die unabhngig vom Typ des verwendeten Tandem-Massenspektrometers herang
27、ezogen werden knnen. Wenn jedoch ein Massenspektrometer mit Ionenfalle verwendet wird, knnen andere Produktionen entstehen, oder die relativen Intensitten der Ionen knnen zumindest unterschiedlich zu Tandem-Massenspektrometern sein. Ferner sind die weiteren Parameter wie die Spannung, die zur Zerstr
28、ung von Clustern verwendet wird (declustering potential, DP), die Kollisionsenergie (CE), die relativen Retentionszeiten und eine ungefhre relative Angabe zur Detektionsempfindlichkeit in Tabelle 1 dargestellt. Diese Parameter sind mit dem API 20001)erstellt worden und sollten mindestens auch fr and
29、ere API-Gerte (Applied Biosystems) anwendbar sein. 2 Analyt-spezifische Parameter fr das selective reaction monitoring“ von Pestiziden 2.1 Allgemeines Alle Werte in Tabelle 2 sind mit dem oben genannten LC-MS/MS-System unter den Bedingungen nach 2.2 erhalten worden. Vergleichende Untersuchungen habe
30、n gezeigt, dass diese Parameter auch recht einfach auf andere Gertetypen desselben Herstellers oder nach entsprechendem Einstellen/Umjustieren auch auf Gerte anderer Hersteller bertragen werden knnen (siehe 2.3). 2.2 LC-Parameter Die folgenden LC-Bedingungen haben sich als geeignet erwiesen. Dies is
31、t ein Beispiel fr Untersuchungs-bedingungen. Andere Bedingungen drfen verwendet werden, wenn sie zu denselben Ergebnissen fhren. HPLC-Pumpe HP11002)Binary Pump (G1312A) Autosampler HP1100(G1313A) Injektionsvolumen 20 l 1) Instrumente des API-Typs sind Produkte von Applied Biosystems (Foster City, CA
32、, USA). Diese Information dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieses Technischen Berichtes und bedeutet keine Anerkennung des betreffenden Produktes durch CEN. Gleichwertige Produkte drfen verwendet werden, wenn nachgewiesen werden kann, dass sie zu den gleichen Ergebnissen fhren. 2) Instrument
33、e des HP-Typs sind Produkte von Agilent Technologies Inc. (Palo Alto, CA, USA). Diese Information dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieses Technischen Berichtes und bedeutet keine Anerkennung des betreffenden Produktes durch CEN. Gleichwertige Produkte drfen verwendet werden, wenn nachgewiese
34、n werden kann, dass sie zu den gleichen Ergebnissen fhren. CEN/TR 15641:2007 (D) 6 Sule Phenomenex3)Aqua 5 C18 125 , 50 mm 2 mm Mobile Phase A Methanol/Wasser 2 + 8 (V/V) mit 5 mmol/l Ammoniumformiat Mobile Phase B Methanol/Wasser 9 + 1 (V/V) mit 5 mmol/l Ammoniumformiat Durchfluss 0,2 ml/min Sulent
35、emperatur 20 C Gradient Linear: 0 min 0 % B 11 min 100 % B 23 min 100 % B 25 min 0 % B 36 min 0 % B (Equilibrierzeit) Da geringe Abweichungen in den Messbedingungen die Retentionszeit beeinflussen, werden blicherweise die relativen Retentionszeiten (RRT) verglichen, die auf eine Standardsubstanz bez
36、ogen werden. Als Standardsubstanz fr die Berechnung der RRT-Werte in Tabelle 1 diente Imazalil (RRT = 1,000). Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung anderer mobiler Phasen die Reihenfolge der Elution nicht stark beeinflusst. Eine Ausnahme bilden jedoch einige Analyten, deren Elution vom pH-We
37、rt des Eluenten abhngt. In der Regel knnen die Retentionsdaten auf HPLC-Sulen anderer Hersteller bertragen werden, wenn normale Umkehrphasen verwendet werden. 2.3 Allgemeine MS/MS-Parameter Die folgenden allgemeinen MS/MS-Untersuchungsbedingungen haben sich als geeignet erwiesen. Dies ist ein Beispi
38、el fr geeignete Untersuchungsbedingungen. Andere Bedingungen drfen verwendet werden, wenn sie zu denselben Ergebnissen fhren. MS/MS-Gert Applied Biosystems API 2000Ionenquelle Turbo Ion Spray(ESI) Tabelle 1 Ionenquelle und allgemeine Parameter Ionenpolaritt positiv Gas 2 Temperatur 400 C entgegenstr
39、mendes Gas Stickstoff, 35 psi (241 kPa) Auflsung MS 1 Einheit Kollisionsgas Stickstoff, 2 Einheiten Auflsung MS 2 Einheit Ionenspray-Spannung 5500 V Haltezeit (dwell time) 25 ms Gas 1 Stickstoff, 60 psi (414 kPa) Fokussierpotential 360 V Gas 2 Stickstoff, 60 psi (414 kPa) 3) HPLC-Sulen des Aqua-Typs
40、 sind Produkte von Phenomenex (Torrance, CA, USA). Diese Information dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieses Technischen Berichtes und bedeutet keine Anerkennung des betreffenden Produktes durch CEN. Gleichwertige Produkte drfen verwendet werden, wenn nachgewiesen werden kann, dass sie zu de
41、n gleichen Ergebnissen fhren. CEN/TR 15641:2007 (D) 7 2.4 Analyt-spezifische MS/MS-Parameter Die Analyt-spezifischen Parameter fr das selective reaction monitoring“ von Pestiziden sind in Tabelle 1 aufgelistet 1. Die Namen der individuellen Analyte sind durch die CAS-Nummer (Chemical Abstracts Servi
42、ce) ergnzt, die fr die Suche in Datenbanken hilfreich ist. Sie sind blicherweise aus 2 entnommen, aber in einigen Fllen kann es mehrere Nummern geben, z. B. fr Isomere und Racemate. Die Werte fr die Spannung zur Zerstrung von Clustern (DP), die in Tabelle 1 fr den API 2000angegeben werden, mssen um
43、20 V fr die Tandem-Massenspektrometer des Typs API 3000oder API 4000erhht werden. Es muss bercksichtigt werden, dass das DP bei zu hohen Werten nicht nur die Cluster aufbricht, sondern bereits zur Fragmentierung der Precursor-Ionen in der ESI-Quelle fhren kann. ANMERKUNG Es ist nicht erforderlich, d
44、ie Kollisionsenergie zwischen API 3000- und API 4000-Gerten zu ndern, da die Unterschiede weniger als 5 V betragen. Bei der Verwendung von Tandem-Massenspektrometern anderer Hersteller sollte der korrekte Wert fr die Kollisionsenergie in vorhergehenden Versuchen fr Analyten mit speziell geringer und
45、 hoher Kollisionsenergie bestimmt werden, da sie die Intensitt des SRM-Massenbergangs deutlich beeinflusst. Auf diesen Daten basierend knnen die Werte fr die Kollisionsenergie von weiteren Pestiziden annherungsweise von den Daten in der Tabelle und der beobachteten Differenz (Differenz der CE beim G
46、ert X zum API 2000) abgeschtzt werden. Die Werte der Spannung zur Zerstrung von Clustern (andere Bezeichnung cone voltage“) fr andere Gerte mssen jeweils individuell bestimmt werden. Verglichen mit dem vorherigen Parameter hat die Kollisionsenergie einen geringeren Einfluss auf die Intensitt des SRM
47、-Massenbergangs. Tabelle 2 MS/MS-Parameter von 497 Analyten Pestizide (Metaboliten) 1. SRM 2. SRM CAS No.Ionisation Quasi-Moleklion Q1Masse(amu) DP c (V) Q3Masse(amu) Kollisionsenergie (V)Q3Masse(amu) Kollisionsenergie (V)RRTaufUmkehrphase mitendcappinga Nachweisempfindlichkeitb2,4-D 94-75-7 ESI -M-
48、H-219,0 -21 160,9 -14 124,9 -34 0,69 * 2,4-DB 94-82-6 ESI-M-H-247,0 -66 160,8 -12 124,9 -34 0,86 * 2-Naphthyloxyessigsure 120-23-0 ESI +M+NH4+220,1 36 157,1 19 127,1 43 0,66 n.a. 2-Naphthyloxyessigsure 120-23-0 ESI -M-H-201,1 -71 143,0 -18 114,9 -50 0,66 * 3,4,5-Trimethacarb 2686-99-9 ESI+M+H+194,1
49、61 137,1 15 122,0 35 0,86 * 4-CPA 122-88-3 ESI-M-H-185,0 -71 126,8 -18 140,7 -12 0,47 * Acephat 30560-19-1 ESI +M+H+184,1 6 124,9 25 142,9 13 0,11 * Acetamiprid 135410-20-7 ESI+M+H+223,0 36 126,0 27 90,1 45 0,58 * Acibenzolar-S-methyl 135158-54-2 ESI +M+H+210,9 26 136,1 39 140,0 31 0,92 * Aclonifen 74070-46-5 ESI+M
