1、1第 30 讲 微生物的利用考纲要求 1.大肠杆菌的培养和分离。2.分离以尿素为氮源的微生物。考点一 微生物的培养和分离1.培养基与无菌技术(1)培养基含义 微生物生存的环境和营养物质成分水、无机盐、碳源和氮源，还需满足不同微生物生长对 pH、特殊营养物质以及氧气的要求LB 培养基：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、水、琼脂(固体培养基)各成分的作用蛋白胨、酵母提取物：为细菌生长提供碳源和氮源氯化钠：维持一定的渗透压琼脂：凝固剂，不易分解，一般不作为营养物质。其在 96时融化成液体，冷却到 45以下即重新凝固种类按物理状态分：固体培养基、半固体培养基、液体培养基按特殊用途分：基础培养基、加富培养基、
2、选择培养基和鉴别培养基按培养的微生物分：细菌培养基(pH 呈中性偏碱，添加有机物如蛋白胨、酵母提取物，还要添加氯化钠以维持渗透压)、霉菌培养基(pH 呈中性偏酸，添加无机物或添加蔗糖的豆芽汁)(2)灭菌操作项目 灼烧灭菌 高压蒸汽灭菌 过滤灭菌适用材料或用具接种环、接种针或其他金属用具培养基、培养皿、试管等玻璃器具等尿素等加热会分解的物质灭菌条件及时间在酒精灯火焰上充分灼烧，直至烧红，冷却后备用LB 培养基：121(1kg/cm 2压力)、15min含葡萄糖的培养基：90以上(500g/cm2压力)、30min玻璃器皿：高压蒸汽灭菌后放入G6 玻璃砂漏斗过滤26080烘箱中烘干2.大肠杆菌的培
3、养和分离(1)大肠杆菌特性：大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧(代谢类型)的肠道杆菌，在肠道中一般对人无害，但若进入人的泌尿系统，就会对人体产生危害。用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具。(2)细菌的培养和分离细菌的繁殖：以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约 20min 分裂一次。培养的方法：需要将已有细菌的培养物转移到新的培养基中，一般用接种环(工具)转移带菌的培养物。细菌分离的方法与特点分离方法 特点划线分离法 操作简单涂布分离法 操作复杂，单菌落更易分开(3)大肠杆菌的培养和分离实验实验内容：将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用 LB 液体培养基扩大培养大肠杆菌，培养后再在 LB 固体平面培养
4、基上划线进行分离，随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。实验步骤50 mL LB 液体培养基和 50 mL LB 固体培养基及培养皿进行高压蒸汽灭菌将培养基分别倒至 4 个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养 12 h用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿培养基灭菌倒平板接种划线分离培养观察培养皿倒置(盖在下面)，放在 37 恒温培养箱中培养 1224 h 后，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落大肠杆菌分离的用途：单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。3.
5、微生物两种常用的接种方法比较3比较 划线分离法 涂布分离法工具 接种环 玻璃刮刀原理通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，但操作复杂些目的 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体菌落(1)玻璃砂漏斗用后需用 1mol/L 的 HC
6、l 浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液呈中性，干燥后保存( )(2)科研人员在超净台上进行接种操作时，为了保证无菌环境，打开紫外灯和过滤风( )(3)倒平板时，应将打开的培养皿盖放到一边，以免培养基溅到培养皿盖上( )(4)用 涂 布 分 离 法 纯 化 大 肠 杆 菌 时 ， 只 要 稀 释 度 足 够 高 ， 就 能 在 培 养 基 表 面 形 成 单 个 菌 落 ( )(5)划线分离法简单并且可以用来计数，涂布分离法使单菌落更易分开，但操作复杂些( )(6)微生物的分离和培养实验结束后，将培养基倒入废料桶并用清水将器皿清洗干净( )(7)下图中甲为划线分离法中最重要的环节，乙为操作的
7、结果：每一次划线后都要灼烧接种环( )除第一次划线外，每一次划线的起点都是第一次划线的末端( )观察甲、乙、丙、丁四幅图和两种接种方法接种后培养的效果图，请思考：4(1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙乙甲丁。(2)甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。(3)丁中的操作需要等待平板冷却凝固才能进行。(4)下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请思考：获得图 A 效果和 B 效果的接种方法分别是什么？提示 获得图 A 效果的接种方法为涂布分离法，获得图 B 效果的接种方法为划线分离法。某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样
8、操作才可避免此种现象？提示 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌。应采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。1.(2018杭州一模)据报道，一些企业生产的速冻食品中检出金黄色葡萄球菌超标，加上熟卤制品的大肠杆菌超标， “细菌门”事件引起公众普遍关注。金黄色葡萄球菌能分解卵黄中的卵磷脂，在含卵黄的固体培养基上形成的菌落周围会出现特有的乳白色的乳浊环。请回答下列问题：(1)某生物兴趣小组欲检测某果汁类食品中是否含有金黄色葡萄球菌以及该菌的含量。配制培养基：称取适量的牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂等，加入蒸馏水，搅拌加热至完全溶解后_，分装到锥形瓶后
9、利用_进行灭菌，在无菌状态下加入卵黄液(100mL10%灭菌 NaCl 溶液中加一个鸡蛋黄，振荡均匀)摇匀后立即倒平板。接种：该小组采用涂布分离法检测果汁样品中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_；然后，将 1mL 果汁样品稀释 10 倍，在 3 个平板上用涂布分离法分别接入 0.1mL 稀释液。培养及结果：将培养皿_放入恒温培养箱中经适当培养，3 个平板上的菌落数分别为 19、18 和 17。据此可得出每升果汁样品中的活菌数为_个。(2)示意图 A 和 B 中_表示的是用涂布分离法接种培养后得到的结果。5(3)下列有关常用涂布分离法的操作正
10、确的是_。A.在超净工作台中进行接种时应关闭紫外灯B.接种前需先稀释，然后过滤除去杂菌C.在每个固体培养基表面都可形成单菌落D.玻璃刮刀浸泡在 70%的酒精中灭菌，不用灼烧(4)菌种保存：在无菌条件下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在_上，在37下培养 24h 后，置于 4冰箱中保存。答案 (1)调 节 pH 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 检 测 培 养 基 平 板 灭 菌 是 否 合 格 倒 置 1.8106 (2)B (3)A (4)斜面解析 (1)培养基配制好后应调节酸碱度(pH)，分装到锥形瓶后利用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。涂布接种前，将制好的空白平板先培养一段时间，目的是检测培养基平
11、板灭菌是否合格；接种后，培养皿需要倒置培养，防止皿盖上凝集的水滴滴落造成污染；0.1mL 稀释液(稀释 10 倍)含细菌数约为 18 个，得出每升果汁含有活菌数 1.8106个。(2)图中 A 为划线分离得到的结果，B 为涂布分离得到的结果。(3)在超净工作台进行接种操作时应关闭紫外灯，A 正确；涂布分离前需稀释，但不能过滤除菌，B 错误；稀释度较大的溶液涂布分离不一定出现单菌落，C 错误；玻璃刮刀浸泡后需要灼烧，D 错误。(4)纯化的菌种保存在斜面上。2.(2018宁波 3 月联考)研究小组从土壤中筛选以多环芳烃(PAHs)为碳源和能源的细菌，用以降解工业废水和生活污水中的 PAHs。请回答
12、：(1)为了从土壤中筛选 PAHs 降解菌，需配制以_为唯一碳源的培养基，培养基经_A.121 (500 g/cm2压力)，15min B.90(500 g/cm2压力)，15 min C.121 (1 kg/cm2压力)，15min D.90(500 g/cm2压力)，30 min高压蒸汽灭菌，待冷却至 60后倒平板。(2)倒平板时应使锥形瓶的瓶口通过火焰，目的是_。在倒平板的过程中，如果培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，则这个平板不能用来培养 PAHs 降解菌，原因是_。(3)制备土壤稀释液时，用_法接种于固体培养基表面；培养时，需将培养皿_并放在 37恒温培养箱中培养 24h。(4)用划线
13、分离法纯化 PAHs 降解菌的过程中，在第二次及其后的划线操作时，应从上一次划线的末端开始划线，原因是_。答案 (1)PAHs C (2)防止杂菌污染 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上6滋生 (3)涂布分离 倒置 (4)使细菌数量随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而成的菌落解析 (1)为了筛选以 PAHs 为碳源的细菌，应保证培养基中 PAHs 为唯一碳源；配制好的培养基经高压蒸汽灭菌法灭菌，温度为 121(1kg/cm 2压力)，灭菌 15min。(2)倒平板时使锥形瓶的瓶口通过火焰，目的是防止杂菌污染。若培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，则空气中的微生物可能在此
14、部位的培养基上滋生，故该平板不能使用。(3)土壤稀释液用涂布分离法接种，培养皿需倒置培养。(4)划线分离法中第二次及其后的划线操作要从上一次划线的末端开始，原因是上一次划线末端菌数减少，有利于进一步分离。3.(2019舟山质检)下列是有关大肠杆菌的培养实验，请回答问题：(1)配制培养大肠杆菌的培养基时，根据“细菌喜荤，霉菌喜素”的规律，通常在培养基中加入蛋白胨和_作为营养物质，为维持一定的渗透压，常需加入一定量的_。(2)大肠杆菌的培养和分离实验中，在_中进行扩大培养，培养液经_后，在 LB 固体培养基上进行_，并将培养皿_放在恒温培养箱中培养，可以获得如图所示效果。为了检测接种、培养过程是否
15、受到杂菌污染以及_，应同时将未接种的培养基放入相同条件的恒温培养箱中培养。(3)依据_的形状、大小等特征对获得的纯菌种进行初步的鉴定。(4)下列关于“大肠杆菌的培养和分离”的操作中，叙述正确的是_。A.高压蒸汽灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖B.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上C.为了防止污染，接种工具经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落D.用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上答案 (1)酵母提取物 NaCl (2)LB 液体培养基 稀释 分离 倒置 无菌操作是否规范 (3)菌落 (4)D解析 (1)配制培养大肠杆菌的培养基时，根据“细菌喜荤，霉菌
16、喜素”的规律，通常在培养基中加入蛋白胨和酵母提取物作为营养物质，为维持一定的渗透压，常需加入一定量的NaCl。(2)大肠杆菌的培养和分离实验中，在 LB 液体培养基中进行扩大培养，培养液经稀释后，在 LB 固体培养基上进行分离，并将培养皿倒置放在恒温培养箱中培养；为了检测接种、培养过程是否受杂菌污染以及无菌操作是否规范，应同时将未接种的培养基放入恒温培养箱中培养。(3)依据菌落的形状、大小等特征对获得的纯菌种进行初步的鉴定。(4)高压蒸汽灭菌加热结束，等待压力表指针回到零后，才能打开放气阀，开启锅盖，不能直接打开放气阀7使压力表指针回到零，A 错误；倒平板过程中不能打开培养皿的皿盖，以防止杂菌
17、污染，B错误；接种环在火焰上灼烧后，待冷却后才可以快速挑取菌落，C 错误；用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上，D 正确。1.对无菌操作的理解(1)灭菌的原因：为了获得纯净的培养物，防止外来杂菌的污染。(2)无菌操作的条件：各种器皿必须无菌；培养基必须无菌；细菌接种、转移等操作过程必须无菌。(3)避免培养物被杂菌污染的方法注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率，手和实验服要清洁，减少操作时间，胆大心细。注意微生物的生长条件，如 pH、渗透压、温度等。 “细菌喜荤，霉菌喜素” ，细菌喜欢在中性偏碱的环境中生长，霉菌喜欢在中性偏酸的环境中生长。因此，可根据不同微生物的“喜好”来减少污染
18、。2.划线分离操作中的有关问题(1)在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束后，仍然需要灼烧接种环。第一次灼烧 每次划线之前灼烧 划线结束灼烧目的避免接种环上可能存在的微生物污染培养物杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境或感染操作者(2)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。(3)在进行第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的末端开始划线。每次划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始划线，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
19、3.进行恒温培养时，要将培养皿倒置的原因如果正放培养皿，则皿盖上形成的水滴会落到培养基表面并且扩散开，会冲散菌体，污染菌落，达不到分离的目的，因此恒温培养时，培养皿必须倒置。8考点二 分离以尿素为氮源的微生物1.菌种特点含有脲酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源。2.培养基用以尿素为唯一氮源的培养基培养，以 LB 全营养培养基为对照。3.实验原理(1)筛选以尿素为氮源的微生物，可使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养选择。(2)细菌合成的脲酶能将尿素分解成 NH3，致使 pH 升高，使酚红指示剂变红。4.实验步骤5.反应的鉴定在配制培养基时，加入指示剂酚红，培养时细菌将尿素分解并产生碱性的氨
20、，使培养基上菌落周围出现红色的环带。(1)分离以尿素为氮源的微生物时，配制的培养基中加入酚红作为酸碱指示剂，加入琼脂作为凝固剂( )(2)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类( )(3)从物理性状的角度看，选择培养基多属于固体培养基( )(4)对细菌进行计数只能采用涂布分离法，而不能用划线分离法( )(5)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源( )(6)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低( )如图为分离以尿素为氮源的微生物的实验，思考回答下列问题：9(1)实验目的是使用含有尿素的培养基分离能产生脲酶的细菌，使用酚红作为指示剂。(2)有脲酶的细
21、菌菌落周围出现有色环带的原因是什么？提示 细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解产生呈碱性的氨，遇培养基中的酚红指示剂产生颜色变化，形成红色环带。(3)制备尿素固体培养基的过程中采用的灭菌方法有高压蒸汽灭菌法、G6 玻璃砂漏斗过滤法。(4)从上图所示实验过程中可判断出细菌悬液 C 的稀释度为 104 。1.幽门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下： 配 制 培 养 基 灭 菌 、 倒 平 板 X 培 养 观 察请回答下列问题：(1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为 Hp 含有_，它能以尿素作为氮
22、源；若有 Hp，则菌落周围会出现_色环带。(2)下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是_灭菌。A.高压蒸汽 B.紫外灯照射 C.70%酒精浸泡 D.过滤(3)步骤 X 表示_。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液_到培养基平面上。菌液稀释的目的是为了获得_菌落。(4)在培养时，需将培养皿倒置并放在_中，若不倒置培养，将导致_。(5)临床上用 14C 呼气试验检测人体是否感染 Hp，其基本原理是 Hp 能将 14C 标记的_分解为 NH3和 14CO2。答案 (1)脲酶 红 (2)D (3)接种 涂布 单 (4)恒温培养箱 无法形成单菌落 (5)尿素10解析 (1)幽门螺杆菌(Hp)含有脲酶
23、，能以尿素为氮源，在加入尿素和酚红指示剂的培养基中培养 Hp，由于尿素经脲酶的降解可产生碱性的 NH3，NH 3能使培养基中的酚红由红黄色变成红色，故菌落周围会出现红色环带。(2)由于尿素加热会分解，对尿素溶液进行灭菌最好用 G6 玻璃砂漏斗过滤。(3)微生物的分离和培养步骤：配制培养基灭菌、倒平板接种培养。为获得单菌落，接种操作前应先将菌液稀释，然后将菌液涂布到培养基平面上即可。(4)微生物培养时需将培养皿倒置并放在恒温培养箱中，若不倒置培养，则无法形成单菌落。(5)幽门螺杆菌能将 14C 标记的尿素分解为 NH3和 14CO2，故临床上常用 14C 呼气试验检测人体内幽门螺杆菌的存在。2.
24、(2018绍兴市鲁迅高级中学期中质检)回答下列问题：尿素是一种高浓度氮肥，且长期施用没有不良影响，但尿素只有通过土壤中某些细菌的分解作用，才能被植物吸收利用。某同学要分离出土壤中能分解尿素的细菌，并尝试进行计数，培养基配方如下：K2HPO4 NaCl H2O 葡萄糖 尿素 酚红 琼脂0.12g 0.12g 15mL 0.025g 2.0g 0.25mg 0.5g(1)上述培养基配制完成后，应选择_法灭菌，根据培养基的成分推断，该同学能否分离出土壤中只分解尿素的细菌？_(填“能”或“否”)，推断理由是_。(2)分离得到分解尿素的细菌后，则应选择_培养基进行扩大培养。培养一段时间后，要借助显微镜对
25、微生物细胞进行计数。计数过程中，下列哪种行为会影响计数的准确性_。A.计数时直接从静置培养的试管底部取培养液进行计数B.如果方格内微生物细胞数量多于 300 个，应将培养液先稀释后再计数C.如果微生物细胞有粘连，要数出团块中的每一个细胞D.压在方格线上的细胞只计左线和上线上的细胞数(3)为了提高尿素肥效，可以将分解尿素的酶和尿素混合，制成“加酶尿素” 。为了提高“加酶尿素”中酶的利用率，可采用_技术。答案 (1)高压蒸汽灭菌 否 琼脂是未纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，导致尿素不是唯一的氮源 (2)液体 A (3)固定化酶解析 (1)高压蒸汽灭菌适合于耐高温的物品，如培养基、金属器械、玻
26、璃等，题中培养基配制完成后，应选择高压蒸汽灭菌；该同学不能分离出土壤中只分解尿素的细菌，因为琼脂是未纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，导致尿素不是唯一的氮源。(2)应选择液体11培养基进行扩大培养；由于重力作用，试管底部培养液中细菌种群密度较大，应将培养液摇匀后进行计数。(3)为了提高“加酶尿素”中酶的利用率，可采用固定化酶技术，使酶与尿素分开，可重复利用。3.(2018浙 江 名 校 新 高 考 联 盟 联 考 )请 分 析 回 答 以 下 关 于 分 离 以 尿 素 为 氮 源 的 微 生 物 实 验的 问 题 ：(1)脲酶可以催化尿素分解为_，其中碱性物质能使酚红指示剂变为_。(2)
27、分离以尿素为氮源的微生物，配制培养基时必须加凝固剂_，培养基在_g/cm 2压力下灭菌 30 分钟，冷却至 60，加入通过_的尿素溶液，混合均匀待用。(3)为了从土壤中分离得到以尿素为氮源的微生物，分离效果比较好的操作方法是釆用_，釆用该方法分离，土壤溶液必须经过_处理。答案 (1)NH 3和 CO2 红色 (2)琼脂糖 500 G6 玻璃砂漏斗过滤 (3)涂布分离法 稀释解析 (1)脲酶可以催化尿素分解为 NH3和 CO2，其中碱性物质能使酚红指示剂变为红色。(2)分离以尿素为氮源的微生物，配制培养基时必须加凝固剂琼脂糖。培养基在 500g/cm2压力下灭菌 30 分钟，冷却至 60，加入通
28、过 G6 玻璃砂漏斗过滤的尿素溶液，混合均匀待用。(3)涂布分离法是从土壤中分离得到以尿素为氮源的微生物的最简便的方法，采用该方法分离，土壤溶液必须经过稀释处理。培养基的选择作用(1)选择培养基的概念选择培养基是指根据某种微生物的特殊营养需求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。在培养基中往往加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长，从而提高对该菌的筛选效率。(2)选择培养基的常用设计方案加入青霉素的培养基：分离酵母菌、霉菌等真菌。加入青霉素、卡那霉素等抗生素的培养基：分离导入了目的基因的受体细胞。加入高浓度食盐的培养基：分离金黄色葡萄球菌。不加氮源的无氮培养
29、基：分离固氮菌。不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物。加入氨基蝶呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基：分离杂交瘤细胞。提醒：使用选择培养基对微生物进行筛选时，需设置对照实验，一般选择 LB 全营养培养基作为对照。(3)选择培养基与鉴别培养基的区别一般来说，选择培养基能够筛选出所需要培养的微生物，促进其生长，抑制其余种类的微生12物的生长。而鉴别培养基往往通过显色反应，只需用肉眼辨别颜色就能从近似菌落中找到目的菌菌落，但不能抑制其余种类的微生物生长。例如，利用伊红美蓝培养基可鉴别分解乳糖的大肠杆菌，菌落呈紫黑色且带有金属光泽。探究真题 预测考向1.(2016浙江 10 月选考)请回答从土壤
30、中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有关问题：(1)LB 固体培养基：取适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸馏水溶解，再加_，灭菌备用。(2)尿素固体培养基：先将适宜浓度的尿素溶液用_灭菌过的 G6 玻璃砂漏斗过滤，因为 G6 玻璃砂漏斗_，故用于过滤细菌。然后将尿素溶液加入到已经灭菌的含有酚红的培养基中，备用。(3)取适量含产脲酶细菌的 104 、10 5 两种土壤稀释液，分别涂布接种到 LB 固体培养基和尿素固体培养基上，培养 48h，推测固体培养基上生长的菌落数最少的是_(A.10 5 稀释液尿素固体培养基 B.10 5 稀释液LB 固体培养基 C.10 4 稀释液尿素固体培
31、养基 D.104 稀释液LB 固体培养基)。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现_，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生_所致。(4)制备固定化脲酶时，用石英砂吸附脲酶，装柱。再用蒸馏水洗涤固定化酶柱，其作用是_。答案 (1)琼脂糖 (2)高压蒸汽 孔径小，细菌不能滤过 (3)A 红色环 氨(或 NH3) (4)除去游离的脲酶解析 (1)LB 固体培养基的成分组成是蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、蒸馏水、琼脂(糖)。(2)尿素固体培养基的制备：先将含有酚酞的固体培养基高压蒸汽灭菌，待冷却至 60时加入灭菌的尿素溶液，但要注意尿素溶液的加入需用到高压蒸汽灭菌后的 G6 玻璃砂漏斗过滤，原因是
32、G6 玻璃砂漏斗的孔径小，细菌不能通过，便于除菌。(3)LB 固体培养基含有的营养元素全面，培养基上会有较多菌落，而尿素培养基只有尿素为唯一氮源，培养基上有较少菌落。尿素培养基上细菌产生的脲酶将尿素分解为 NH3，使菌落周围的含酚酞的培养基变成红色环。(4)制备固定化脲酶可用吸附法将脲酶固定在石英砂上，用 10 倍体积的蒸馏水冲洗固定化酶柱，目的是除去未吸附的游离的脲酶。2.(2015浙江自选)某工厂为了生产耐高温植酸酶饲料添加剂，开展了产该酶菌株的筛选、酶的固定化及其特性分析研究，其流程如下图所示。 土 样 中 的 菌 株 筛 选 菌 株 鉴 定 优 良 菌 株 扩 大 培 养 植 酸 酶
33、提 纯 植 酸 酶 固 定 化 植 酸 酶 特 性 分 析13请回答：(1)土壤悬液首先经 80处理 15 分钟，其目的是筛选出_。(2)在无菌条件下，将经过处理的土壤悬液进行_，然后涂布于含有植酸盐的固体培养基上。培养后观察到_，其周围出现透明水解圈，圈的直径大小与_强弱相关。(3)筛选获得的菌株经鉴定后，将优良菌株进行液体扩大培养。培养时需要振荡，其主要目的是_。液体培养基与固体培养基相比，不含有的成分是_。(4)在合适条件下，将提纯的植酸酶与海藻酸钠混合后，滴加到一定浓度的钙离子溶液中，使液滴形成凝胶固体小球。该过程是对酶进行_。A.吸附 B.包埋 C.装柱 D.洗涤(5)温度与植酸酶相
34、对酶活性的关系如图所示。下列叙述错误的是_。A.测试温度中，固定化与非固定化植酸酶的最适温度分别为 60和 45B.测试温度范围内，固定化植酸酶的相对酶活性波动低于非固定化植酸酶C.固定化与非固定化植酸酶相比，相对酶活性在 80%以上时的温度范围较宽D.65时固定化与非固定化植酸酶的相对酶活性因蛋白质变性而位于最低点答案 (1)耐高温菌株 (2)稀释 单菌落 植酸酶的活性 (3)供氧 琼脂 (4)B (5)D解析 (1)欲获得“耐高温”植酸酶合成菌株，需在“高温”条件下筛选目的菌株。(2)若对产植酸酶的菌株进行选择培养，宜在无菌条件下，将经过处理的土壤悬液进行稀释，然后用涂布分离法将菌液涂布于
35、含有植酸盐的固体选择培养基上，培养基上可呈现以植酸酶合成菌菌落为中心的透明圈，圈的直径大小与植酸酶活性呈正相关。(3)对筛选获得的优良菌株进行液体扩大培养时，为满足菌株需氧呼吸对 O2的需求，宜进行振荡处理，与固体培养基相比，液体培养基中不需添加琼脂等凝固剂。(4)将海藻酸钠与提纯的植酸酶混合，滴加到一定浓度的钙离子溶液中，使液滴形成凝胶固体小球，此操作应属于包埋法固定化酶技术。(5)图示曲线变动趋势表明，相对于非固定化植酸酶，固定化植酸酶其活性波动明显降低，且酶活性温度范围更加宽泛；非固定化酶的最适温度为 45，而固定化酶的最适温度为 60；图中 65并非固定化植酸酶活性的最低点，由以上分析
36、知，AD 中 A、B、C 均正确，D 错误。3.(2018浙江 11 月选考，32(一)回答与微生物培养及应用有关的问题：14(1)对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从_时开始计时。对于不耐热的液体培养基，一般可将其转入 G6 玻璃砂漏斗中，采用_方式可较快地进行过滤灭菌。(2)与酿造果醋相比，利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋，需增加_的过程。某醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中甘露醇的主要作用是_。(3)为筛选胞外 -淀粉酶分泌型菌种，一般从_(A.果园树下 B.肉类加工厂周围 C.米酒厂周围 D.枯树周围)获得土样，用无菌水稀释，涂布到含有淀粉的选择培养基上培养，
37、一段时间后在培养基表面滴加碘液，可在菌落周围观察到透明的水解圈。若要筛选酶活性较高的菌种，需挑选若干个_比值大的菌落，分别利用液体培养基振荡培养进行扩增。然后将培养液离心，取_用于检测酶活性。答案 (1)达到设定的温度或压力值 抽滤(2)将淀粉分解成糖 作为碳源(3)C 水解圈直径与菌落直径 上清液解析 (1)高压蒸汽灭菌的计时时间从达到设定的温度或压力值开始，采用抽滤方式用 G6 玻璃砂漏斗进行过滤灭菌。(2)将 淀 粉 分 解 成 糖 ， 便 于 微 生 物 的 利 用 ， 醋 化 醋 杆 菌 培 养 基 中 的 甘 露 醇 的 主 要 作 用 是 作 为碳 源 。(3)筛选富含 -淀粉酶
38、的菌种要在富含淀粉的环境中筛选，故选 C。水解圈直径与菌落直径比值越大说明菌种分泌的酶活性越高。课时作业一、选择题1.下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是( )A.步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行B.步骤中，待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖C.步骤中，每次划线前后都需对接种环进行灼烧处理D.划线接种结束后，将图平板倒置后放入培养箱中培养答案 B解析 由图可知，步骤是倒平板，步骤是用接种环蘸取菌液，步骤是进行平板划线，步骤是培养。步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行，防止被杂菌污染，A 项正确；倒完平板后应立即盖上培养皿的皿盖，冷却后将平板倒过来放置，B 项错误；
39、每次划线前后15灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落，C 项正确；划线接种结束后，将平板倒置放入培养箱中培养，有利于培养基表面的水分更好地挥发和防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，D 项正确。2.下列关于大肠杆菌的培养的叙述，不正确的是( )A.在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑 pH、温度和渗透压等条件B.若对大肠杆菌活菌进行计数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品的稀释度合适C.在微生物培养操作过
40、程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行消毒D.使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃答案 C解析 微生物培养条件有营养条件、pH、温度、渗透压等，A 正确；为计数活菌数，要多次实验求平均值、操作要严格，还要保证样品的稀释度合适，便于检测，B 正确；为防止杂菌污染，对培养基和培养皿要进行灭菌，C 错误；为防止对环境的污染，用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，D 正确。3.下图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为 1、2、3、4、5。下列操作方法正确的是( )A.操作前要将接种环放在火焰旁灭菌B.划线操作应在火焰上进行C.在 5 区域中才有可能得到所需菌落D.在 1
41、、2、3、4、5 区域中划线前后都要对接种环进行灭菌答案 D解析 操作前要将接种环放在火焰上灼烧灭菌，A 项错误；划线操作应在火焰旁进行，B 项错误；在 5 区域中最有可能得到所需菌落，C 项错误；在 1、2、3、4、5 区域中划线前后都要对接种环进行灭菌，D 项正确。4.细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )A.接种环、手、培养基 B.高压锅、手、接种环C.培养基、手、接种环 D.接种环、手、高压锅答案 C解析 一般来说，灭菌是指彻底杀灭微生物，使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀
42、死物体表面或内部一部分微生物，而对被消毒16的物体基本无害，操作者的手需要消毒。高压蒸汽灭菌锅是灭菌设备，通常用于培养基的灭菌；用酒精擦拭双手是消毒的一种方法；火焰灼烧可以迅速彻底灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。二、非选择题5.(2019嘉兴模拟)自生固氮菌是一种能独立固定氮气的细菌，其中有些好氧种类能产生PHB(一种生物可降解的热塑性塑料)。现欲从活性污泥中分离、纯化、筛选出高产 PHB 的固氮菌，操作流程如下：采集土样富集培养分离、纯化培养初步筛选 PHB 固氮菌筛选高产 PHB 固氮菌保存备用。请回答：(1)富集培养时，为达到筛选自生固氮菌的目的，在配制培养液时不应添加_。培养时
43、要将装有培养液的锥形瓶放置在摇床上振荡培养，其目的是为细菌的生长提供_。(2)筛选高表达量菌株的方法之一是经涂布分离获得_。进行分离、纯化培养时，要先将培养基倒入_中，制成平板，此时所使用的培养基与富集培养时有所不同，添加了一定量的_。(3)在纯化过程中，在固体培养基上划线时，下列操作正确的是_。A.接种环采用 70%酒精灭菌B.接种时应在酒精灯火焰附近进行C.划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连D.划线分离时，需要把接种环深入培养基中进行接种答案 (1)含氮物质(或氮源) 充足的氧气 (2)单菌落 培养皿 琼脂糖 (3)B6.(2018浙江五校 9 月联考)某村庄有一条小溪，近几年由于
44、上游几家乳胶厂不断向其中排放废水，小溪变得不再清澈。某同学想测定该溪水中的细菌含量情况。回答下列问题：(1)先根据所学知识制备 LB 培养基。制备该培养基的步骤：计算称量溶化灭菌倒平板，下列关于制备 LB 培养基的叙述，错误的是_。A.培养基应先调 pH 再进行灭菌B.培养基应先灭菌再分装到培养皿C.溶化琼脂时不能使培养基溢出或烧焦D.灭菌时一般用高压蒸汽灭菌锅在 121，500g/cm 2压力下灭菌 15 分钟(2)该同学利用上述制备的培养基来检测水样中的细菌数量，他所选择的分离方法应是_；该同学在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_。接种在超净工作台上进行，工作台上实验前一段时间需打开，实验中需关闭的是_(A.酒精灯 B.照明灯 C.紫外线 D.过滤风)。(3)值得注意的是，他所选择的这种方法统计的结果往往比实际细菌的数目要低，这是因为(不考虑实验操作原因引起的细菌数目的变化)：17_。_。(4)该同学欲将所分离出的某种细菌临时保藏，应接种到试管的_培养基上，等菌落长成后，放入冰箱低温保藏。答案 (1)D (2)涂布分离法 检查平板灭菌是否彻底 C (3)该方
