1、IR-SEQ,目录,免疫组库（IR） 免疫组库测序技术 信息分析,1、免疫组库概念,免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。研究免疫组库就要测定免疫系统中的BCR和TCR的基因或RNA分子序列。 影响免疫组库组成的因素有很多种。比如年龄、疾病、免疫记忆、免疫缺陷遗传疾病、疫苗、器官移植、癌症治疗等。,根据淋巴细胞DNA来源的不同，对于免疫组库的研究分为以下几大类：健康人士一般采用抽取外周血的方式；特殊人群比如白血病人或者白血病细胞微小残留病（MRD）患者，为了深入研究其免疫组库的变化也将骨髓血作为淋巴细胞D
2、NA的来源；刚出生的婴儿，其脐带血可以用于研究人在出生早期与母亲在免疫组库方面的联系与区别；而对于动物来说尤其是小型动物，脾脏也是常见淋巴细胞的DNA来源脏器。 以唾液和尿液作为淋巴细胞DNA来源的方式。 ,2、BCR,B细胞受体（BCR）又称为免疫球蛋白（IG），它是由B细胞分泌的可以和抗原结合的蛋白质分子。成熟的B细胞可以将IG分泌到细胞外面以中和抗原。免疫球蛋白由两条重链（heavy chain, H），两条轻链（light chain, L）中间通过二硫键连接而成。重链（IGH）由 Variable（V），Diversity（D），Joining（J）和Constant（C）基因片段重
3、组而来；轻链（IGL）只由V-J-C重组而来。重链（H链）又分为V区、C区、跨膜区及胞质区；而轻链（L链）则只有V区和C区。V区由VH和VL两个结构域组成，各有3个CDR即CDR1、CDR2和CDR3。,决定B淋巴细胞识别抗原的关键部位是最具多样性的重链CDR3区，其多样性的产生源于IGHV（51个功能性基因片段）末端-IGHD(23个功能性基因片段）-IGHJ前端（6个功能性基因片段）基因重排及V-D和D-J连接时非模板依赖性核苷酸插入或剪切和体细胞高频突变等。,3、TCR,T细胞受（TCR）是由T细胞分泌的膜蛋白分子，与BCR不同的是TCR只在细胞表面而不分泌出去。一个T细胞的TCR可以是
4、链和链组成的，或者由链和链组成的。链和链由V-J-C基因片段重组而来，链和链由V-D-J-C基因片段重组而来，这也类似于BCR的重链和轻链。参与特异性免疫应答的T淋巴细胞主要是/ T淋巴细胞，占外周淋巴细胞的90-95%。TCR 链CDR3在抗原特异性识别中起关键作用，是直接与抗原肽的结合位点，其编码基因位于人类7号染色体（7q34），全长620kb，由50多个可变区（V区）基因片段、2组上游D基因片段/下游恒定区（C区） 基因片段、67个J区基因片段组成，这些基因在T淋巴细胞发育早期不连续分布，在胸腺内原始T细胞阶段，D-J区片段连接为 DJ片段；在成熟T淋巴细胞阶段，V、D、J、C区基因片
5、段相连成 VDJC片段。,据推测，胚系VDJC基因片段随机组合、重排以及TCR /链和/ 链V区基因重排产生的TCR克隆数量高达1015-1018，构成多样性极其丰富的T淋巴细胞抗原受体库。不同T淋巴细胞克隆有不同序列或长度的TCR-CDR3基因，翻译出不同的CDR3多肽序列，从而反映T淋巴细胞功能状态。在发生特异性免疫应答时，TCR多样性发生变化，出现寡克隆甚至单克隆扩增，随着胸腺再生，大量原始T淋巴细胞增殖，TCR免疫组库多样性得以恢复和重建。,不同VDJ基因片段组合的多样化； 不同基因片段连接时随机插入删除造成连接的多样化，V(D)J连接区核苷酸的插入和删除，体现为互补决定区簇CDR3)
6、序列多样性； 不同重链和轻链组合的多样化； 以及 B 细胞受体特有的随机高频突变。,4、BCR/TCR多样性产生机制,5、研究免疫组库的流程,提取样本DNA/RNA:根据所要研究的问题设计试验方案，提取血液或组织样本，分离B细胞或T细胞，然后提取和纯化DNA/RNA。 构建测序文库:根据不同实验情况加入不同扩增引物进行PCR扩增，从而扩增出想要测序的免疫基因，最后构建测序文库。 测序:利用二代高通量测序仪，如Roche 454、Illumina Hi Seq2500、Illumina Mi Seq等进行测序。 信息分析:对测出来的序列数据进行信息挖掘，来发掘出生物学意义与结果。数据分析主要包括
7、数据清理、质量控制、不同样本数据分离、序列比对、序列注释以及下游的各种分析。,二、免疫组库测序,1、免疫组库测序概念,免疫组库测序（Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ)）是以 T/B 淋巴细胞为研究目标，用多重PCR技术或5RACE扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性的互补决定区（CDR3区），再结合高通量测序技术（HTS），全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系。,2、两种PCR技术的优缺点,Arm-PCR是最新开创的一种高效扩增子救援多重PCR，它克服了传统多重PCR的缺限。通过在扩增的早期使用基因靶点特异性的引物，而
8、在指数扩增期使用共用的引物，使得所有模板的扩增效率大大提高，因而具有较高的特异性和灵敏性。,3、模板比较,基因组虽然DNA容易制备，但PCR扩增过程中易产生非产出性的重组序列，且J-C区之间存在的大量内含子使其下游引物只能位于J区，PCR扩增的敏感性一般由细胞的拷贝量决定；相对而言，RNA需取自新鲜的标本，其产物多为产出性的CDR3序列，下游引物可选自C区，具有高度的敏感性。,4、主流测序技术及优缺点,免疫组库分析的精确性依赖于HTS数据的可靠性。而HTS数据的可靠性又依赖于测序的准确性和覆盖的深度。,Thermo测序平台,Ion Torrent:革新性的半导体芯片测序技术平台 原理是：向 D
9、NA 聚合物中加入 dNTP，会释放出氢离子。我们采用半导体测定这些氢离子引起的 pH 变化，通过同时测量数百万起此类变化，可以测定各个片段的序列。 高效靶向覆盖-运用多重PCR设计实现平均97%靶向覆盖 读长-可选择200bp或400bp读长,5、信息分析,1、基本数据统计数据过滤，对原始数据进行去除接头污染序列及低质量reads的处理数据搭建，数据拼接，消除测序背景及有效数据构建数据统计，数据产出统计及测序数据的成分和质量评估 2、数据比对分析比对分析，与数据库（IMGT）V/D/J基因片段比对重新比对，寻找最佳V/D/J比对结果 3、序列结构分析分析CDR序列组成及序列碱基成分分析CDR
10、序列的碱基插入和缺失编码CDR序列翻译成氨基酸和肽链,4、免疫组库构建构建免疫组库表达谱，统计多样性抗体库克隆表达情况免疫组库多样性呈现，绘制V/J基因表达的2D、3D图 5、免疫组库差异分析样品间多样性差异分析（辛普森系数、香农威纳系数）样品间克隆表达差异分析（CDR3，V-D-J）分组样品间的克隆表达差异分析（CDR3，V-D-J）,6、IR-SEQ存在的问题,1、构建免疫组库的过程实际上是基于多重引物PCR来覆盖BCR或TCR序列多样性的过程，这就会涉及多重引物之间扩增效率导致的偏好性的问题，一套好的多重引物总会平衡各对引物之间的扩增效率以及尽量避免引物间的非特异性扩增和二（多）聚体，可
11、以说构建的免疫组库质量的好坏直接取决于其多重引物质量的高低。,2、以人体内BCR为例，保守估计BCR的种类多样性在1011这一数量级级别上，其中骨髓方面占17%，全身淋巴结占到28%，脾脏和粘膜系统占23%，外周血方面仅占2%，其他约占30%。然而我们对人免疫组库的研究往往是以来源方便的外周血，显然外周血对免疫组库多样性的贡献率2%远远不足，为了能尽量完全地反映人群的免疫组库全貌，我们可以通过增加样本量的方式来弥补单个人外周血免疫组库不能反映免疫组库全貌的不足，但是巨大的样本量又让人望而却步。,3、免疫组库的多重引物并不通用，每个物种甚至每个种系的引物都可能不尽相同。这意味着每研究一种新的物种的免疫组库，我们都要重新设计合成该物种的多重引物以及PCR条件等。另一反面，有的物种胚系基因序列不全甚至没有，这也给多重引物的设计带来一定的麻烦。,
