1、Approaches and Techniques in Research on Tumor A course for Ph.D. candidates,肿瘤的实验动物和细胞研究技术,The animal model and in vitro research of tumor,常用研究方式：In Vitro: 体外研究，细胞、组织培养下进行In Vivo: 体内研究，人类疾病的动物模型Ex Vivo: 细胞经体外实验处理后，再回输到体内体外处理：转染基因或改变环境(用一些因子)使其分化等,体外研究(In Vitro )原代培养肿瘤细胞: 从肿瘤组织中分离得到的细胞在体外成功地进行培养称为原代
2、培养(primary culture)肿瘤细胞系:原代培养肿瘤细胞能连续传代（约710天传代一次）半年以上,生长稳定, 并能保持肿瘤细胞的特性，称为肿瘤细胞系(cell line)肿瘤细胞株:细胞系经细胞克隆或其它方法获得具有某种生物学特性的纯谱系的细胞称为肿瘤细胞株(cell strain), 细胞具有相同的基因型和表型(单克隆),肿瘤细胞株的建立： 1、 直接从人的肿瘤或动物的自发及诱发肿瘤组织分离培养建系和建株; (从自发或诱发瘤)2、从人或动物的移植肿瘤(如人肿瘤裸鼠移植瘤)组织分离培养建系及建株; (从移植瘤)3、用化学或生物(病毒)方法在体外转化正常的人或动物的细胞株而获得肿瘤细胞
3、株。(体外转化),肿瘤细胞株的鉴定：1. 有关的原始资料,包括供瘤病人的姓名、年龄、性别、病历号、临床诊断（TNM）、活检病理诊断,手术切除日期、最后病理诊断等2.形态学观察:普通倒置相差光镜:活细胞的形态, 细胞间桥,分泌颗粒,重叠生长,Giemsa染色或H.E.染色的光镜形态与肿瘤细胞的生长条件有一定关系:HeLa: 高浓度血清长梭形;低浓度血清圆形细胞,排列如鹅卵石路面;透射和扫描电镜3D组织结构,3. 核型及染色体观察: 整倍体,异倍体,染色体畸变、标记染色体,染色体分带分析, 相隔一定时间重复观察数次4.生长特性: 分裂指数（3H-thymidine或5-BrdU的labeling
4、index）、生长曲线、细胞群体倍增时间、集落形成或贴壁率（plating efficiency）半固体培养介质中的集落形成率5.组织特性的鉴定: 免疫细胞化学方法,上皮性肿瘤标志: CK、上皮膜抗原（EMA）、 癌胚抗原（CEA）;淋巴瘤抗原标志: 人白细胞分化抗原簇（CD）,有274个以上,T淋巴细胞: UCHL-1(CD45RO),B淋巴细胞: L26（CD20）,软组织肿瘤标志：波形蛋白（Vm）肌源性：结蛋白（Dm）、肌动蛋白、肌凝蛋白、肌红蛋白神经源性： 神经微丝（NF）、S-100蛋白、 Leu-7、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、髓磷脂碱性蛋白(MBP)组织细胞源性： -1抗胰蛋
5、白酶、 -1抗糜蛋白酶、CD68血管源性：八因子相关抗原、CD34、荆豆凝集素(UL)基膜源性：纤连蛋白（FN）和层粘连蛋白（LN） 体外培养时肿瘤细胞株有可能会失去原本表达的某些组织抗原,抗原标志要多选用几种抗体,以减少假阴性结果;,6. 其他特性：(a) 分泌激素和异位激素: 绒毛膜癌HCG垂体瘤生长激素肺燕麦细胞癌和一些甲状腺癌ACTH人肺巨细胞癌细胞株（PLA-801）促性腺激素肝癌HCG(b) 肿瘤细胞的受体表达: ER PR AR(c) 酶及同工酶活性: 酶活性保持(HTC酪氨酸氨基转移酶)、变化诱导剂 糖皮质激素、多肽激素改变培养条件：谷氨酸替代谷氨酰胺脑星形胶质细胞谷氨酰合成酶
6、活性增7倍左右特异的同工酶谱： 绒癌T3M-3表达胎盘性碱性磷酸酶,(d) 癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表达：高转移人卵巢细胞系HO-8910PM表达：p53 p16 bcl-2 nm-23 CD44v6 c-erbB-2 EGFR 等基因的蛋白产物不表达：Bax基因的蛋白产物,7. 细胞株交叉污染的检测： 细胞遗传学方法：染色体分析特异的染色体标志探针作FISHG带核型分析鉴别同种肿瘤细胞Q带分析检测人Y染色体免疫学方法：HLA或动物的组织相容性抗原的测定生化方法：同工酶谱或其它生化指标,8. 微生物污染的检测：细菌：培液混浊，高倍镜下隐约可见均匀散在细小菌体真菌：培液混浊，高倍镜下可见菌丝
7、或孢子病毒：病毒核酸和蛋白产物支原体：以核酸（DNA）荧光染色即H-stain(Hoechst 33258，即二苯并咪唑染色)较为常用, 356nm光的激发下可发出458nm的强荧光,体外正常细胞恶性转化的鉴定正常细胞体外恶性转化的鉴定指标(14项指标)（第二届全国细胞和组织培养专题讨论会通过）核型分析出现非整倍体能在软琼脂培养基中增殖并形成集落异种动物接种能生成肿瘤端粒保持不变或延长以及端粒酶活性的增高,指标 正常细胞 转化的纤维母细胞 转化的上皮细胞形态 伸展良好,折光较弱;核质比小, 梭形,伸展较差,折光较强;核质比大, 与正常细胞之间差别不如纤维母细胞胞质嗜碱性弱;核仁较小较少; 胞质
8、嗜碱性强,核仁较大较多;多核巨细胞 大;多形性较常见多核巨细胞较少 较多 粘附性 细胞间粘附性较强,紧贴瓶壁生长 粘附性差,易脱落 差别不明显 生长特性 排列有方向性,单层生长,存在密度 方向性消失,多层重叠,密度依赖性抑制消失 差别不明显,某些细胞株呈重叠生长依赖性抑制 对血清的依赖 较高 较低 差别不明显扫描电镜观察 微绒毛少 微绒毛丰富 微绒毛不稳定,有时增多植物凝集素引起的凝集 弱 较弱 较强细胞表面的糖蛋白和糖脂 正常 糖基化不完全 糖基化不完全纤维连接蛋白 正常存在 减少或消失纤溶酶原激活酶 较低 增高 不稳定,某些株增高胞质中微丝微管的排列 规则 紊乱 不稳定胞质cAMP浓度 较
9、高 较低 核型 二倍体 非整倍体或假二倍体 非整倍体琼脂培养 不生长 生长 生长接种异种易感动物 不长肿瘤 长肿瘤 长肿瘤,世界各国的细胞库（cell bank）及索引美国 美国典型培养细胞库（American Type Culture Collection, 即ATCC, Rockville,MD）人与动物细胞培养目录（Catalog of Human and OtherAnimal Cell Cultures, Naval BiosciencesLaboratory, Cell Culture Department, Naval Supply Center, Oakland,CA) 人基因
10、突变细胞及老年细胞培养库（Human Genetic Mutant Cell Culture and Ageing Cell, Culture Repositories, Institute for Medical Research, Camden, NJ) 欧洲 真核细胞培养库(Culture de Cellules Eucaryotes, Repertoire des Utilisateurs., M. Adophe, D.Gourdji, A.Tixier-Vidal, R. Robineaux, Inserm Publications,101 Rue de Tobiac,75654 P
11、aris, Cedex 13 医学病毒学系（Department of Medical Virology,Institute de Pasteur, Paris)欧洲动物细胞培养库（European Collection for Animal Cell Cultures,即ECACC, PHLS/CAMR,Porton, Salisbury, England)欧洲人类基因突变细胞库(European Human GeneticMutant Cell Bank, Department of Clinical Genetics,Erasmus University, Rotterdam)日本 癌细
12、胞系库(Collection of Cancer Cell lines, National Institute of Hygenic Sciences, Tokyo)普通细胞库( General Cell Bank, Institute of Physical and Chemical Research of RIKEN, Saitama)Flow Laboratories; GIBCO,特殊表型肿瘤细胞系（株）：高转移人肝细胞性肝癌细胞株MHCC97人黑色素瘤细胞株MV3、卵巢癌细胞株HO-8910PM、肺巨细胞癌细胞株PGBE1高度耐药人红白血病细胞株K562/ADM对阿霉素的抗性增114
13、.7倍分泌产生激素、蛋白、酶或一些因子人肺小细胞癌细胞株LU-165抗利尿激素;人肺腺癌细胞株LC-2/ad1-抗胰蛋白酶人红白血病细胞株K562高表达端粒酶,体内研究(In Vivo)肿瘤动物模型：自发性肿瘤诱发性肿瘤移植性肿瘤.,一、自发性肿瘤种系：大鼠的自发肿瘤不如小鼠多见，大动物更为少见Sinclair猪到一岁时有85%可发生恶性黑色素瘤品系：C3H小鼠 乳腺癌发病率为97% BALB/c 乳腺癌发病率低AKR小鼠 淋巴细胞性白血病发病率为70%90%近交系SJL/J小鼠 淋巴瘤(何杰金病)自发率高达91%缺点：发病迟,发病时期不集中,发病率也不稳定,二、诱发性肿瘤优点：发生率、发病时
14、间、发生部位及组织学类型均易控制实验结果重复性相对较好1.化学诱癌动物肿瘤模型1775年英国医师Pott 扫烟囱 阴囊癌1914年,日本学者山极和市川 煤焦油 皮肤癌1934年Yashida用邻氨基偶氮甲苯诱发大鼠肝癌成功我国从1960年代开始进行化学诱癌动物模型的研究1956年亚硝胺和1961年黄曲霉毒素的致癌作用相继被发现,(1) 化学致癌物 诱发时间相对较短有剂量-效应关系基因毒化学致癌物一般具有高度亲电子性，与生物大分子中富于电子的亲核残基相结合,影响硷基对的正常配位或大分子的结构与功能正常细胞的癌变.直接致癌物和前致癌物（间接致癌物）,常见化学致癌物:1) 多环碳氢化合物: 25种以
15、上, 以煤焦油的主要成分3,4-苯并芘和3-甲基胆蒽的致癌性最强2) 氨基偶氮化合物: 二甲基氨基偶氮苯亦称二甲基黄(奶油黄),3-甲基-4,4-二甲基氨基偶氮苯(3-Me-DAB) 3)芳香胺类: 苯胺印染工厂 吸入乙萘胺在肝变为氨基苯经肾排出联苯胺膀胱癌 2-乙酰氨基芴(2-AAF) 4)亚硝胺类: 亚硝酸盐+二级胺亚硝胺类化合物 强致癌物 致癌谱甚广不同分子的亚硝胺化合物仍有一定的器官亲和性对称衍生物如二烷基亚硝胺肝癌不对称的亚硝胺食管癌,5)霉菌毒素: 种类较多首推黄曲霉毒素(aflatoxin),存在于霉变的花生、玉米及谷物中, 6)金属元素 :砷、铬、镍、肺癌镉前列腺癌.(2)影响
16、化学致癌的因素,1) 动物方面 品系: 诱发肝癌时：F-344大鼠对DEN和2-AAF的敏感性要比其它品系的大鼠高诱发皮肤肿瘤：BALB/c和SENCAR品系小鼠对DMNU、DENU的敏感性大大高于Swiss品系小鼠 性别: 2AAF诱发肝癌：小鼠60%发生肝癌,小鼠不敏感.F-344大鼠,比更敏感 年龄: 一般而言,动物年龄越小,对化学致癌物越敏感,敏感性： 胎鼠新生鼠成年鼠,2) 化学致癌物方面剂量阈值:启动因子（initiator）不表现明显的剂量阈值促癌因子（promotor）则有剂量阈值一般的化学致癌物往往兼有启动和促癌的作用,因此仍可表现有剂量阈值如3-Me-DAB (60ppm)
17、 致癌强度: 诱发大鼠肝癌总剂量:DAB为1000mg3-Me-DAB为600mg,2-AAF为250mg,DMN只需100mg;,诱癌潜伏期: 诱发肝癌：AFB1需时约1年,3-Me-DAB与2-AAF约半年左右,DEN一般只需3个月; 诱癌靶器官: 诱癌谱：相对专一，如3-Me-DAB一般只引起肝癌,较广，如亚硝胺类可诱发多器官肿瘤; 化学致癌物的相互作用:多数 协同作用而加速致癌,少数 会产生拮抗作用.有的化学物质单独使用时本身不致癌,但可增强致癌物作用（促癌物）,3)诱癌方案（carcinogenic regimen）和方法,半年后,12周后,喂正常饲料(代表1周),喂含0.06%3M
18、e-DAB的饲料,喂含0.02%2-AAF的饲料,部分肝切除,苯并蒽(Benzanthracene),直接涂擦皮肤,注射至皮下,产生皮肤癌,产生纤维肉瘤,非基因毒致癌物(non-genotoxic carcinogen)美国公布的301种化合物中,162种可致鼠类肿瘤其中 36%不引起细胞DNA的改变44%不引起细胞突变致癌机制？促进细胞增殖？抑制细胞凋亡？其它未知？,2 生物因子诱发动物肿瘤模型(1) 病毒诱发动物肿瘤模型 1908年Ellermann和Bang 白血病鸡的无细胞滤液诱发鸡白血病获成功白血病、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、皮肤癌、肾癌等,与病毒感染有关1) DNA病毒 多瘤病毒(Py
19、V)疱疹病毒(herpes virus sylvilagas)2) RNA病毒 急性RNA肿瘤病毒：潜伏期较短(34周),大部分肉瘤病毒、禽白血病病毒、个别小鼠白血病病毒(如Abl-MuLV)都属于本组.该组病毒基因组结构常有缺陷,需辅助病毒协助才能复制慢性RNA肿瘤病毒： 潜伏期较长(412月)，大部分动物白血病病毒属于本组,（2）其它生物因子诱发的动物肿瘤模型幽门螺杆菌感染SPF级的BALB/c小鼠,22月以后,38%的实验小鼠胃有淋巴滤泡增生,25%的小鼠胃出现形态类似人胃粘膜相关淋巴瘤的病变（B细胞淋巴瘤）,3. 转基因动物肿瘤模型Stewart等获得13个MMTV-LTR/myc融合
20、基因的转基因小鼠系,其中两株c-myc启动子为MMTV-LTR启动子中糖皮质激素受体反应元件所取代,在早期妊娠时即发生自发性乳腺癌。Chisari等HHBV的S基因、病毒增强子和X基因转基因小鼠, HBsAg的积聚引起内质网明显扩张,出现肝细胞毛玻璃样改变,100%小鼠发生肝脏肿瘤X基因和病毒增强子的质粒X基因转基因小鼠, 21月龄时, 两个品系转基因小鼠肝肿瘤发生率分别为75%82.8%,三、移植性肿瘤可移植瘤株：将一种动物肿瘤移植到同系同种或异种动物,经传代（20代）, 组织形态特征逐渐稳定，即成为同种或异种动物的可移植瘤株。移植瘤来源：动物自发性肿瘤或诱发性肿瘤我国用615近交系小鼠的自
21、发瘤建立了：肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病等移植瘤株用诱发瘤建立了：小鼠宫颈癌（U27及U14）小鼠前胃癌（Fc）肝细胞癌等移植瘤株。,近交系动物的应用： 1962年,苏格兰医师Dssacson和 Cattanach发现（裸小鼠）*移植性人肿瘤裸鼠模型广泛应用1、免疫缺陷动物 (1) T细胞免疫功能缺陷动物 裸小鼠：*先天性胸腺发育不良(妊娠1415天可见少量胸腺痕迹,并非全无胸腺)*胸腺依赖性T细胞明显减少或缺乏,*B细胞仍然存在,但功能低下,免疫球蛋白以IgM为主,*NK细胞有较强活力。纯合子的裸大鼠：基因符号rnu。特征与裸小鼠相似无胸腺大鼠,(2)B细胞免疫功能缺陷动物 B细胞功能衰退,血
22、浆IgM、IgG低下,T细胞功能尚属正常CBA/N系小鼠Arabian和Quarter马(3)联合免疫缺陷及其它免疫缺陷动物 CBA/NNU小鼠 T、B淋巴细胞功能均缺陷;严重联合免疫缺陷小鼠（SCID）：突变基因scid位于第16对染色体纯合子小鼠T、B淋巴细胞极度低下,NK细胞和抗原传递细胞功能尚正常先天性联合免疫缺陷型小鼠：NK细胞、T、B细胞功能联合缺陷裸小鼠：缺点：*需在 germ-free或SPF条件下饲养，较苛刻*平均寿命仅1430d。,2、人肿瘤免疫缺陷动物模型移植成功率: 取决于移植方法：人癌组织直接移植的成功率平均为30%人癌细胞株为6070%肿瘤本身：成功率最高结肠癌、胃
23、癌、黑色素瘤;其次胰腺癌裸小鼠胰腺内原位移植、宫颈癌、食管癌等;较低前列腺癌、乳腺浸润癌、淋巴网织系统肿瘤和白血病裸小鼠品系：人前列腺癌BALB/c成功率仅2%（3/150）NMRI裸小鼠可达35%（6/16）其它： 接种部位宿主遗传背景年龄和建康状况等,(1)人组织裸鼠诱癌模型诱发鼻咽癌青少年慢性鼻咽增殖体炎鼻咽活检或刮除组织移植于NC系裸小鼠二亚硝基哌嗪（NDP）为致癌剂 鼻咽上皮增生巴豆油A因子（TPA）为促癌剂 乳头状增生、不典型增生原位癌诱发肺癌裸鼠体内人类气管、支气管培养成功也为用人材料诱发肺癌的实验奠定了基础,(2)人肿瘤裸鼠移植模型*1969年丹麦的Ryggard 人结肠癌移植
24、于裸小鼠*100余种人类恶性肿瘤裸小鼠移植模型：癌肿 肝、肺、胃、结肠、食管、胰腺、乳腺、前列腺、鼻咽、淋巴造血系统肿瘤软组织肿瘤其它 黑色素瘤、视网膜母细胞瘤*1978年Festing首次进行裸大鼠人癌异种移植 *1983年我国建成甲胎蛋白阳性裸大鼠人肝癌模型LTNR与LTMR2两株,(3)人肿瘤转移裸鼠模型我国始于80年代中期 肺癌、肝癌转移及胃癌肝转移和淋巴道转移等 1)人肺癌高转移裸小鼠模型吴秉铨等将6株人肺癌细胞系移植BALB/cA,nu/nu/JCLB裸小鼠其中一株肺巨细胞癌细胞系移植建成高转移模型,定名为PG带瘤存活30天以上裸小鼠中 淋巴结转移(29/30) 肺转移(26/30
25、)传17代后,瘤组织再移植裸小鼠(存活30天)淋巴结转移 (12/12) 肺转移(9/12) 转移率达100%2)人肝癌高转移裸小鼠模型孙肪宪,汤钊猷等用30例人肝癌组织直接移植于46周龄的BALB/cA,nu/nu裸小鼠,移植部位在小鼠肝实质内或肝包膜下其中一例39岁男性(巨块型肝细胞癌伴肝内播散和淋巴结转移)其移植瘤育成人肝癌高转移裸鼠模型,定名为LCI-D-20鼠间连续传代(16代)成功率100%,间期为20天肺、淋巴结及肝内转移(72/72), 腹腔种植转移(50/72), 转移率达100%,3)其它胃癌肝转移杨善民等用人低分化胃粘液腺癌细胞系MGC80-3在BALB/c裸小鼠建成移植
26、瘤后再用移植瘤单细胞悬液接种于裸小鼠脾包膜下肝内胃癌转移率达60%用CCl4处理裸小鼠,肝内胃癌转移率可达100%,其它脏器则未见转移淋巴结转移李斯德等将人小细胞癌NCI-H128细胞系接种裸小鼠腹股沟、腋窝和颌下淋巴结出现转移淋巴结转移率达100%,3 应用肿瘤的生物学特性 浸润转移临床治疗 基因治疗 导向治疗药敏测定法（SRC） 实验可评价率为93%新抗癌药物开发筛选,Molecular OncologySome Molecular Methodology in Tumor Research,一、基因变异的诊断基因表达异常肿瘤基因突变：转位，重排 Southern blot，PCR点突变
27、DGGE硷基缺失 CDGESSCP基因丢失：SSCPMicrosatellites analysis,DGGE=Denaturing Gradient Gel Electrophoresis CDGE=Constant Denaturing Gel Electrophoresis SSCP=Single Strand Conformation Polymorphism,PCR-SSCP: year 1989, Orita M Gene,PCR,Homozygote Hetrozygote,Heating(50) for 10 min + formamide,Non denaturing PAG
28、E(300V,5h, silver staining),PCR-SSCP 灵敏度高，一个硷基的改变可在电泳速度上反映出来 但DNA片段的大小与灵敏度有关 100-300 bp 突变检出率 97% 300-500 bp 检出率 67% 以200 bp 左右为佳,PCR-SSCP的主要步骤： DNA模板制备（从石蜡组织中提取）脱蜡：少许石蜡组织放入Eppendorf管+1ml 二甲苯65，5 分钟离心，5分钟，弃上清重复一次1 ml EtOH,振摇后离心5分钟，弃上清1 ml EtOH(70%),振摇后离心5分钟，弃上清真空离心5分钟，使干燥,消化： 180ml pH8.0 TE +20ml bu
29、ffer +10ml proteinase K(20mg/ml)55,3-5h加50ml Chelex-100(25%水溶液)55 ,1h100, 10 minspin,3 min 提纯DNA： 上清+ 200ml phenol,剧烈振摇离心，3 min上清+phenol/choroform,振摇离心，3 min水相+25ml NaOAc 3M,1ml glycogen,750mlEtOH(pure)-20, over nightspin 15 min,at 4pellets washed with EtOH70%spin, pellets resuspended in 100-200ml T
30、E,pH8,2. Run PCR注意：PCR产物最好在200 bp左右琼脂糖电泳条带清晰 PCR产物 run 非变性PAGE制胶（36%MDE 胶，or 6% polyacrylamide）稀释样品（1mlPCR产物+4ml去离子水）alkaline denature, (+1ml NaOH,4ml去离子水）50水浴10min后+stop solution 2ml )12ml/well20恒温，300伏恒压下电泳5h,Alkaline stock solution: 0.5 M NaOH+10mMEDTA Stop solution: 1ml formamide(99%pure) +20ml
31、0.5M EDTA(pH8.0) +50ml 1% bromophenol +25ml 1% xylene cyanol,4. 胶染色PAGE胶作记号（左下角切去小）入10%醋酸固定20min胶用去离子水洗三次，每次2min胶入硝酸银溶液反应30min胶用去离子水洗一次，约半分钟胶入还原液还原显色（时间依需要而定）胶入10%醋酸终止反应，约5分钟胶在80下真空干燥2小时,P53基因exon5突变（PCR-SSCP）,N T L N T L,PCR-SSCP的应用：1. 经PCR-SSCP确定DNA片段有突变，该片段经测序可确定突变的形式和定位，可避免因测序或PCR反应出现的碱基配对差错造成的假
32、阳性2. 在无非特异性电泳条带情况下，可以初步确定有无基因的杂合性丢失（Loss of Hetrozygote, LOH),二、检测基因的丢失和扩增比较基因组杂交Comparative Genomic Hybridization,CGH分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合优点：1. 新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可进行CGH研究2. 被测样品只需数mg甚至不到1 mg的DNA,R/G,低度扩增 高度扩增 丢失,不同荧光（红/绿）标记基因组DNA片段（500-2000 bp）,人Cot-1 DNA,对正常人染色体进行原位分子杂交,被测DNA,参照DNA,退火及预杂交,石蜡包埋材料提取的DN
33、A质量较差，可用变性引物对所提取的基因组DNA进行整体扩增 Degeneration Oligonucleotide Primed PCR(DOP-PCR) First step: Primer: 5CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3(DOP) 酶：消除35外切酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶 条件：宽松条件（Low stringency)30/5 min37/2 min96/2 min for 5 cycles,Second step: Template: the product of the first step running Primer: DOP 酶： Taq聚合酶 条件
34、：95/5 min 后进入循环94/1 min56 /1 min72/2 min for 35 cycles72 /5 min 用DOP-PCR只需石蜡包埋材料DNA50 pg(相当于5-10个细胞）即可进行CGH分析，而常规方法需至少200个细胞，两者CGH的图形（profile)是相同的 切片染色不能用HE，而用甲基绿,CGH的应用： 为搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范围 肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数增加，往往提示该位置可能包含已知或未知的癌基因有扩增 肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数减少或缺失，提示该位置可能包含已知或未知的抑癌基因丢失CGH发现MYCN，MET与胃癌
35、相关,区分良恶性病变，临床上估计预后16例前列腺癌CGH显示染色体异常占81%5例良性前列腺增生全部阴性67肝细胞癌CGH显示:1q,8q,20q,17q 4q,8p,13q,16q 12例癌周肝硬化组织：阴性53例淋巴结阴性乳腺癌：8q,11q13,17q,20q异常，预后差,三、检测细胞基因表达谱的差异消减杂交抑制消减杂交cDNA 代表性差异分析SAGEDNA microarraymRNA差异显示（mRNA differential display)RT-PCR + 测序电泳，经典，可重复性可展示10000-15000种mRNA的表达,实质是RT-PCR 引物设计很有特点 锚定引物：12个
36、T可结合mRNA 的polyA上 T12MN M=A，G，CN= A，G，C，T据排列组合，一种T12MN可与1/12的mRNA结合随机引物：可在与poly A末端不同距离的多个位置上结合差异显示的产物是长度不一的cDNA片段的混合物,差异显示的技术路线提取高质量的总RNA，DNA酶处理用锚定引物T12MN进行逆转录 用相同的T12MN引物及随机引物进行PCR扩增（同时用同位素对PCR产物进行标记）测序胶电泳分离PCR产物切下差异表达的条带，用相同引物进行二次PCR扩增PCR产物制成探针Northern blot验证,*相对较敏感：200个细胞的总RNA足够进行差异分析 *低丰度mRNA 的显
37、示不理想对策：（1）先通过消减杂交使差异片刻富集（2）二轮PCR扩增（巢式PCR），第二轮的引物在3端多2个碱基，使与之匹配的模板减少，模板间竞争减少，有利于低丰度mRNA扩增,*降低假阳性： 使用不同浓度的模板进行平行反应，或重复实验以排除由于模板质量或数量引起的假阳性； 严格设定对照，如用缺省逆转录酶或RNA酶降解RNA作为阴性对照来排除DNA污染； 进行差异片段的初筛，把所有的差异片段点在尼龙膜上，然后将研究对象RNA逆转录，掺入同位素制成探针，与此尼龙膜杂交（即反向点杂交），只有那些“此有彼无”的片段才进入下一阶段的研究。,差异表达分析的应用*肿瘤与瘤旁组织或正常组织的基因表达差异表达
38、分析*不同生物学特性的肿瘤（高、低转移表型）基因表达差异分析*细胞经某种细胞因子处理后进行基因表达差异分析，研究该细胞因子作用的下游分子,四、蛋白组学及生物芯片 蛋白组学（proteomics)Y-轴等电电泳或固态pH 2-D gel electrophoresis 梯度电泳X-轴SDS-PAGE银染或荧光染色，找出差异点，挖胶 质谱分析，微量氨基酸测序 BLAST确定是已知还是未知的基因，克隆该基因,生物芯片（biochip) 是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量核酸片段（寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、RNA）或多肽分子甚至细胞等生物样品有序地固定于支持物（玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝
39、胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量改变。,生物芯片：基因芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片 基因芯片( Affymetrix 专利）寡核苷酸芯片，cDNA芯片，基因组芯片DNA microarray:阵密度很高的玻片基质或胶膜基质的DNA微阵列DNA macroarray:阵密度较低的尼龙膜DNA微阵列,五、 肿瘤基因甲基化水平的检测 Methylation of DNA: 甲基化程度与该基因表达呈负相关 甲基化
40、可通过直接或间接作用影响基因表达直接作用：基因构型改变，影响转录因子与DNA特定部位结合；间接作用：调控序列甲基化，可与methyl GC-binding protein结合，阻止转录因子与基因形成转录复合物,甲基化检测方法,Hpa II +Msp I 酶切法Hpa II -CCGG-Msp I-CCmGG-通过电泳分析酶切片段即可知甲基化状态, 5-氮胞苷掺入法：5-氮胞苷胞嘧啶第五位C原子被N原子替代，胞嘧啶无法甲基化基因低甲基化（可传代）经5-氮胞苷处理的细胞，失活的基因可被重新激活, Xiong和 Laird用“COBRA”，即“结合应用酸式亚硫酸盐的内切酶分析”（combined b
41、isulfite restriction analysis,COBRA）来检测启动子中含有CpG的基因的甲基化水平。COBRA原理： 酸式亚硫酸钠（CT）或（mCC） 与CpG甲基化有关的内切酶位点的序列发生转变,CGCG,mCGmCG,CGCG,CGCG,TGTG,CGCG,TGTG,TGTG,Bisulfite,BstU1,注意： 也有例外 有些基因虽有甲基化但仍可转录，相反有些基因虽处于低甲基化状态，但没有转录活性。,Thank you for attending,Suggested topics be focused on in the discussion course,What w
42、ill you add to the list of the approaches and techniques that I have presented, if you have, please give some details. What is your Ph.D. research proposal? What kinds of methods and techniques you intend to use in your research? What are the problems you may encounter and how to solve them? How muc
43、h do you know about RNAi technique? Will you give us some points.,See you next week !,RNAi technique Two types of 21 nt RNAs trigger posttranscriptional gene silencing in cells:small interfering RNAs (siRNA)microRNAs (miRNAs)Dicer Double-stranded RNA precursor siRNA or miRNA Dicer= a member of the R
44、NAase III family of dsRNA-specific endonucleases,The precursor of a miRNA (pri-miRNA) is transcribed in the nucleus. It forms a stem-loop structure that is processed to form another precursor (pre-miRNA) before being exported to the cytoplasm Further processing by the Dicer protein creates the matur
45、e miRNA, one strand of which is incorporated into the RNA-induced silencing complex (RISC),Process and mechanism:pre-miRNA dsRNA synthetic siRNADicer kinaseduplex intermediatehelicase initiates unwinding at easier enddegradation helicase-binded single-stranded guide RNA (miRNA or siRNA)RISC (RNA induced silencing complex)translational repression target cleavage,
