1、第五章 体内药物分析,生物样品特点,1、被测定的药物和代谢物的浓度低； 2、样品大多需要分离和净化； 3、样品量少，连续测定时，很难再度获得完全相同的样品。 4、工作量较大， 5、要求很快地提供结果(毒物检测),样品制备：去除蛋白质、缀合物水解、化学衍生化、分离浓集（液液萃取、固相萃取等）； 样品测定：光谱分析法、色谱分析法、免疫分析法、生物学方法 方法验证：特异性、标准曲线和定量范围、定量下限、精密度与准确度、稳定性、提取回收率,体内药物分析：,第一节、常用体内样品的制备与贮藏,一、体内样品的种类、采集与制备 （一）血样：血浆、血清 血浆：选用最多。因血浆中的药浓可反映药物在体内的状况。而且
2、血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。血浆是全血在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取，量约为全血的一半。,血浆的制备：采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，以25003000r/min离心510min使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆。抗凝剂最常用的是肝素（heparin），肝素是体内正常成分，因此不会改变血样的化学组成或引起药物的变化，一般不会干扰药物的测定。通常1ml血液需用肝素0.10.2mg或20IU(1mg126IU)。可不必准确控制其它抗凝剂EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等，是与血液中的钙离子结合的试剂，它们可能引起被测组分发生变化或干扰某些药物的测定，不常使
3、用。,血清的制备：采集的静脉血液置试管中，于37或室温放置30min1h。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在25003000 r/min离心510min，上层淡黄色液体即为血清。现文献所指血药浓度为血浆或血清中药物总浓度（游离的和血浆蛋白结合的总浓度）。,血浆与血清的区别,血清比血浆只是少一种纤维蛋白原 一般血浆中药物浓度与血清中药物浓度相当 血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50%60%（血清为全血的50%左右），多数用血浆进行分析。 若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品 。,（二）尿样： 尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生
4、物利用度等研究，以及测定代谢物类型等。体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式排出。尿样常需加入防腐剂。,成人一日排尿量为15L。尿样包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。因尿液浓度变化较大，所以应测定一定时间内排入尿中的药物总量。一般采集时间尿（规定时间内采集尿液体积和排入尿中的药物总量）。尿液中药物浓度的改变不能直接反映血药浓度，即与血药浓度相关性较差、尿液量较大不易保存等。,（三）、唾液：唾液中的药物浓度通常与血浆浓度相关。样品易得，取样无损害，尤易为儿童接收。有些可从药物唾液浓度推定血浆中游离药物浓度。 唾液由腮腺、颌下腺和舌下腺三个主要的
5、唾液腺分泌汇集而成前两者分泌量占总量90%。两者中浓度大致相当。取样：在潄口后15min，安静状态下采集口腔内然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰) 。如口嚼石腊片或将柠檬酸、维生素C等置于舌尖，弃去初始部分后采集。刺激后采集的为混合唾液。,药物在脏器组织中的分布情况，常用胃、肝、肾、肺、心等。 制备：测定之前一般需制成匀浆 组织样品的处理：沉淀蛋白法、酸水解法、酶水解法 （蛋白水解酶）,（四）组织：,（五）头发：,应用 体内微量元素含量测定 用药史的估计 临床用药和药物非法滥用的区别 毒性药物检测,头发样品的采集：采集枕部发样(带根部），微量元素在前额部位的头发中含量最低，枕部含量
6、最高。 头发样品的洗涤：除去外源性污染物，推荐使用丙酮-水-丙酮；丙酮浸泡搅拌10min，自来水漂洗3次，再用丙酮浸泡搅拌，自来水、蒸馏水各洗3次。 头发样品的处理：直接甲醇提取、酸水解、碱水解、酶水解（葡萄糖醛酸酶）,三、体内样品的贮存与处理,（一）冷藏与冷冻 血浆和血清需采集后及时分离，一般最迟不超过2h，分离后再置冰箱或冷冻柜中保存（-20-80）。 尿样应立即测定，若收集24h的尿液不能立即测定时，可加入甲苯、氯仿、醋酸等防腐剂，一般可保存2436h，也可加入叠氮化钠较长时间保存。 唾液在保存过程中会放出二氧化碳使pH值升高。另唾液中含有粘蛋白，须离心后冷藏或冷冻 （二）去活性 终止酶
7、的活性方法：快速冷冻、微波照射、加入酶活性阻断剂等。,分析方法与样品处理步骤的选择,第二节、体内样品的的前处理,一、体内样品预处理的目的1、使药物从缀合物及结合物中释放出来，以测定药物的总浓度。2、介质复杂，干扰物多，待测物浓度低，须分离干扰物质、富集待测药毒物3、为了适应和符合测定方法所要求的灵敏度4、为了防止分析仪器的污染、劣化，提高检测准确度、精密度和选择性等。,二、常用体内样品预处理方法 要考虑：药物的理化性质（极性、酸碱性、光谱特性、挥发性、稳定性），药物测定的目的，选用的生物体液和组织的类型，待测物的浓度范围，样品制备与分析技术的关系。,（一）、去除蛋白质,是测定血浆、血清、全血及
8、组织匀浆等样品中药物时的最先处理步骤。 1、加入可与水混溶的有机溶剂（体积比、pH值）破坏蛋白质分子内及分子间的氢键。常加入乙腈、甲醇、乙醇等，能使与蛋白结合状态的药物释放，将混合物超速离心，取上清液作为样品。,2、加入中性盐使蛋白脱水而沉淀，硫酸铵最常用 3、加入强酸与蛋白形成沉淀，阴离子型沉淀剂。如三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸等，在酸性下分解的药物不宜用本法去蛋白。 4、热凝固法加热至90蛋白热变性后离心或过滤除去,（二）分离、纯化与浓集当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时，生物样品需分离、纯化与浓集。,1、液相萃取法,溶剂选择合适的溶剂是成功的主要条件了解药物与溶剂的化学结构及其
9、性质对药物未电离分子可溶，对电离形式分子不溶沸点低、易挥发，毒性小与水不相混溶 不影响紫外检测 具有较高的化学稳定性和惰性不易乳化,23,提取溶剂：极性相似相溶 溶剂的用量：一般有机相与水相之比为1：15：1 溶液的pH调节：最佳pH选择主要与药物的pKa值有关。酸性药物pH应低于药物pKa值12个单位；碱性药物：pH应高于药物pKa值12个单位。 提取：进行一次（至多二次）提取， 浓集：常用吹氮气使溶剂挥散，或减压蒸发（注意暴沸）。,生物样品宜在碱性或近中性提取，生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易被萃取出来。,空白血清在pH2、pH7和pH13三种缓冲液中用乙醚提取，提取液HPLC(
10、220nm)测定，在pH13下提取液中杂质峰最少。,液液萃取特点： 优点：可将大部分内源性杂质去除；经济实用、可使样品富集、可一次进行多个样品萃取 缺点：乳化、污染环境、乳化的去除：加少量固体氯化钠到水相中可减轻乳化；轻微乳化离心；严重乳化低温冰箱快速冷冻破坏乳化层后融化离心。,2、固相萃取法：,以固相分离方法进行样品预处理，从水相中分离出所需测定的组份，通常以柱分离方式进行操作，故有时这种方法又称为固相提取活化上样淋洗洗脱洗脱液浓集,28,固相萃取的模式及原理,反相固相萃取 正相固相萃取 离子交换固相萃取, 阴离子交换 阳离子交换,实验步骤,第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料 第二步：用水或适
11、当的缓冲液冲洗小柱 除去大部分甲醇 第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液 第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除内源性杂质 第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析血浆样品可直接上柱，样品量0.12ml，流速12ml/min,31,本法特点：少溶剂、少污染、减少液液萃取的乳化。适合各种液体检材如血、尿、洗胃液、现场水、饮料等，对于肝、肾、胃以及其他固体检材，均需制成水液方可进行固相萃取。,柱切换高效液相色谱技术是指由阀来改变流动相走向与流动相系统，从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进入分析柱的技术。 用两个或两个以上柱子连接构成色谱网络系统，使
12、不同柱子达到不同分离目标，柱子间用切换阀联结，这就是柱切换技术。 基本原理是首先在预柱上实现生物体液中干扰大分子与待测药物的分离，然后用柱切换将待测药物从预柱转移至分析柱上完成色谱分析。,自动化固相萃取-柱切换高效液相色谱法,3. 超滤法,膜分离技术，可用于测定生物样品中游离药物浓度 按照分子截留量的大小，可分离301000kD的可溶性生物大分子物质。可加压过滤或高速离心。,（三）、辍合物的水解：,酸水解法：强酸、加热 酶解：常用葡萄糖醛酸酶，一般控制pH4.55.5 ，37孵育数小时。 溶剂解：,（四）、化学衍生化,1、使药物变成能被分析的性质 2、提高检测灵敏度 3、增强药物稳定性 4、提
13、高对光学异构体分离的能力 气相色谱衍生化 液相色谱衍生化,衍生化方法：柱前衍生， 柱后衍生,气相色谱衍生化方法：硅烷化、酰化、烷基化、不对称衍生化 液相色谱衍生化方法：紫外衍生化、荧光衍生化、电化学衍生化、手性衍生化,第三节、体内样品分析方法与方法验证,一、分析方法的建立 （一）、分析方法的选择 1、色谱分析法 2、免疫分析法 3、生物学方法,常用分析方法的特点,放射免疫,0.001,（二）、分析方法建立的一般程序 1、色谱条件的筛选：确定最佳分析检测条件；色谱柱(型号、牌号、填料性质、柱长度)；流动相组分及配比、流速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等；使各物质具有足够的方法灵敏度(L
14、OQ)；良好的色谱参数(n、R、T)和适当的保留时间(tR)。,2、色谱条件的优化：,在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：空白溶剂试验 溶剂(方法特异性)空白生物基质试验 内源性物质干扰(方法特异性)模拟生物样品试验 方法验证（效能指标）3、实际生物样品测试,二、分析方法的验证,1特异性避免干扰2标准曲线与线性范围3定量限灵敏度4精密度与准确度结果可重现5样品稳定性 6提取回收率7分析过程的质量控制,体外药物分析,（一）、方法特异性(专属性或选择性),方法的特异性(specificity)又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivi
15、ty)互用系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力专属性表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的选择性系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(分离)的能力,考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：1. 内源性物质的干扰比较待测药物或其活性代谢产物检测信号；2. 代谢产物的干扰比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号；3. 伍用药物的干扰还要考虑患者可能同时服用药物(通常为数有限)的干扰。提供三张色谱图，空白生物样品图、空白加对照、实际生物样品图；4.与参比方法的相关性,（二）、标准曲线与线性范围,标准曲线（standard curve）生物样品中
16、所测定药物浓度与响应的相关性除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式，最小二乘法或加权最小二乘法回归。线性范围：标准曲线的最高Cmax与最低浓度Cmax/20的区间模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度,标准曲线要求,标准曲线用模拟生物样品（与待测的含药生物样品相同的生物基质）建立线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物样品的药物浓度不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度,标准曲线的绘制,以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高) 或与内标物质的检测响应的比值(内标法)(因变量， y )对模拟血药浓度 (自变量，x)求得回归方程( yabx )及其相关系数，( )
17、 0.99(色谱法)或0.98(生物学方法)要求最低浓度点的偏差在20%以内、其余各浓度点的偏差在15%以内。,（三）、定量下限,系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度，又称为方法灵敏度标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点LOQ)要求应能满足测定35个消除半衰期后生物样品中的药物浓度；准确度在80%120%；RSD20%,（四）、精密度与准确度,方法准确度系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的，所以通常使用模拟生物样品测定一般用相对回收率表示,测定： 取高(接近上限
18、)、中、低（定量下限的3倍以内）3个浓度，每一浓度至少5个样本，与随行的标准曲线同法测定、计算方法回收率限度要求：相对回收率应在85%115% (LOQ附近80%120%)RE在15% (LOQ附近为20%),方法精密度(precision )系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度表示该分析方法的可重复性反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点实际生物样品的量有限(如血浆，一般为0.52ml)使用模拟生物样品测定,测定法,照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低 3个浓度的QC样品，并分析测定批内RSD每一浓度5个样品，每个样品测定1次，
19、用随行标准曲线分别计算3个浓度及RSD批间RSD每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；在不同天连续制备并测定3 个合格的分析批，至少45 个样品。,限度要求,在药代动力学和生物利用度研究中对g/ml级水平的RSD一般应10%ng/ml级水平的RSD一般应15%在LOQ 附近RSD应20%。,（五）、样品稳定性,稳定性包括短期稳定性和长期稳定性生物样品的存放条件和时间；冻-融循环(3次），每次冷冻时间应在24h以上；复溶溶剂中的稳定性,（六）、萃取回收率,萃取回收率与相对回收率的意义不同萃取回收率考察生物样品预处理过程造成的药物的损失程度,取空白生物基质(如血浆)，照准确度项下方法
20、，制备高、中、低3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定AT经萃取后的QC样品的检测信号AS未经萃取的标准溶液的检测信号,限度要求,萃取回收率一般应60%高、中浓度的RSD应15%低浓度的RSD应20%。,（七）、分析过程的质量控制方法考察完毕后作实际生物样品的测定，用空白生物介质加入待测药物对照品配制已知浓度样品，考察方法稳定性，推荐由独立的人员配制不同浓度的QC样品对分析方法进行质量监控。每天建立标准曲线用于计算当天测定药物浓度，并随行测定高、中、低3个浓度的QC样品。
21、,（八）、未知生物样品浓度超出定量范围的处理1、浓度高于标准曲线上限：分取部分样品用相应的空白生物介质稀释至方法可测浓度范围后重新测定。2、浓度低于定量限：可增加未知样品的体积，但应在相同的条件下制备QC样品，验证方法的特异性、准确度、精密度。在药代测定时刻不必处理，达峰前以0计，达峰后以无法定量（not detectable）计算，以减少0值对AUC计算的影响。,（九）、作为外源性药物使用的内源性物质的测定1、对生物介质进行处理：活性炭吸附或透析去除所含药物2、使用不含内源性物质的生物介质3、使用替代介质4、采用标准加入法 （十）、微生物学和免疫选方法的验证 （十一）、名词解释标准物质、生物介质、介质效应、标准样品、质控样品、质控样品池、未知样品、制备样品、分析批,
